Name: using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses at JoVE.com

Nous remercions le département de pathologie de l’hôpital Policlinico IRCCS, Milan pour le support technique et l’IEO Animal Facility d’assistance dans l’élevage.

Procédures d’animaux ont été approuvés par le ministère italien de la santé (auth. 127/15 27/13) et suivait les directives de protection des animaux de l’Institut européen d’oncologie IACUC (Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme)
1. chronique de colite Induction par Administration de DSS répétitives
<ol><li>Séparé âge et le sexe correspondant souris en 2 groupes (traitement DSS vs contrôle H2O, au moins 5 autres souris par groupe expérimental).</li...

<ol>
	<li>Gibson-Corley, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+Integration+of+the+Histology+Core+Laboratory+in+Translational+Research.">Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research.</a> Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).</li><li>Olivier, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+species+in+research:+Opportunities+and+challenges+for+the+histology+core+laboratory.">Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory.</a> Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).</li><li>Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+valid+histopathologic+scoring+in+research.">Principles for valid histopathologic scoring in research.</a> Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).</li><li>Stolfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+interleukin-21+in+the+regulation+of+colitis-associated+colon+cancer.">Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).</li><li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development:+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research.">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li><li>Peters, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).</li><li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , (2011).</li><li>Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+mucosal+inflammation+and+their+relation+to+human+inflammatory+bowel+disease.">Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease.</a> Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature. 2, 541-546 (2007).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Cribi&#249;, F. M., Burrello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+automated+inclusion+system+for+the+histological+analysis+of+murine+tissue+samples:+A+feasibility+study+in+DSS-induced+chronic+colitis.">Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis.</a> European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).</li></ol>

Nous utilisons différentes étapes automatisées lors de la préparation des tissus murins pour l’analyse histopathologique. Ce protocole vise à fournir des conseils techniques pour augmenter la reproductibilité et la standardisation de l’ensemble du processus, ce qui améliore la qualité globale de l’évaluation finale histopathologique. Nous avons implémenté des instruments automatisés et méthodes pour la préparation et l’incorporation de tissus, couramment utilisés dans des installations de centrales...

Au cours des dernières décennies, plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour disséquer les mécanismes pathogènes conduisant à des maladies humaines1,2. Afin d’évaluer la gravité d’une maladie, les chercheurs doivent évaluer l’effet d’un traitement et étudier les variations architecturales cytologiques et histologiques ou le montant de l’inflammation,3. Pour effectuer sur ces modèles expérimentaux, des analyses détaillées histopathologiques sont nécessaires, souvent en comparant des échantillons murins et humains4,5.
En outre, des échantillons humains sont généralement traités et marqués par des installations de base histopathologie et expérimentés pathologistes humaines à travers standardisé critères histopathologiques et méthodes. À l’inverse, tissus murins sont habituellement fixes, intégrées et analysés par des chercheurs ayant une expérience limitée des protocoles histopathologiques. La qualité et la fiabilité de l’examen histopathologique commence par la préparation des coupes de tissus de haute qualité. Plusieurs facteurs contribuent critique pour augmenter ou diminuer la qualité de l’analyse finale, y compris la fixation, macroscopique de sectionnement, de transformation, de paraffine incorporation et incorporation des échantillons6,7.
Tous ces passages impliquant la manipulation de l’échantillon sont soumis à des erreurs manuelles, y compris l’intégration manuelle des échantillons et, dans une moindre mesure, manuel microtome de sectionnement et de coloration. À l’heure actuelle, l’ensemble du processus de préparation de tissus murins pour évaluation histologique repose sur des protocoles qui varient d’un laboratoire à et protocoles manuelles. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre des protocoles standardisés et automatisés pour réduire les erreurs et la variabilité dans l’examen histopathologique murine.
À notre connaissance, nous décrivons ici les premiers protocoles pour tissu entièrement automatisé de traitement et d’incorporation d’évaluation histologique des tissus murins ; Ces sont couramment utilisées dans les unités de pathologie pour les analyses d’échantillons humains. Un exemple concret de la faisabilité de la méthode, un modèle murin d’inflammation intestinale a été analysé, c'est-à-dire, le modèle de colite chronique causée par l’ingestion répétée de sulfate de sodium de dextran (DSS) dans l’eau potable8 ,9. Ce paramètre expérimental étroitement ressemble à humaine inflammatoire de l’intestin (IBD) les maladies10 car les animaux traités DSS montrent des signes d’inflammation intestinale, par exemple, perte de poids, selles ou diarrhée et raccourcissement de la colon ainsi que la fibrose 8,9,11. Tel qu’observé pour des patients humains IBD, traitement DSS génère une évolution de la maladie complexe. Dans ce contexte, évaluations histologiques complexes sont nécessaires pour comprendre la profonde altération de l’architecture du tissu. Ainsi, la mise en œuvre des protocoles décrits pour augmenter la qualité de préparation d’échantillon peut-être bénéficier des chercheurs en se fondant sur l’interprétation de histologique et immunohistochimique analyse des paramètres expérimentaux murins. Des modèles expérimentaux murins de maladies humaines impliquant des modifications de l’architecture tissulaire, la présence d’infiltration du tissu cellulaire ou d’inflammation dans différents tissus et organes (intestin, cerveau, foie, peau) pourrait utiliser la qualité accrue de la préparation d’échantillons pour examen histopathologique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414605</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ETOH</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Potassium Sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6435</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>415049</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbol Fuchsin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C4165</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (clone M1/70)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0112-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20 IHC (clone SA275A11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>150403</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (17A2)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0032-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (GK1.5)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552051</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 (clone 104)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109837</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 (53-6.7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer pH 6 10X</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C9999</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dab</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS</td>
			<td>TdB Consultancy</td>
			<td>DB001</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E9884</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Substrate</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex/HRP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex+ Rat Linker</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.09844</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 (clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>2,529,311,215</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>71251</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-Rat-HRP</td>
			<td>Agilent DAKO</td>
			<td>P0448</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>C0303</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Rotary microtome (RM2255)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g (clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury II Oxide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>203793</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis Clearify Clearing Agent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis EnVision Flex TRS</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>GV80011-2</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O3756</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>7052</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peloris</td>
			<td>LEICA</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4937</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without L-Glutamine</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0501-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STS020</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>7022</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Automated paraffin embedder</td>
			<td>Sakura</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>8080.1000</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses

La compréhension des maladies humaines a été considérablement élargie grâce à l’étude de modèles animaux. Néanmoins, histopathologique des modèles expérimentaux doit être aussi rigoureuse que celle appliquée pour les échantillons humains. En effet, tirer des conclusions fiables et précises critique dépend de la qualité de tissu section préparation. Nous décrivons ici un protocole pour l’analyse histopathologique des tissus murins qui implémente plusieurs étapes automatisées au cours de la procédure, de la préparation initiale à l’enrobage de paraffine des échantillons murines. La réduction des variables méthodologiques grâce à la normalisation du protocole rigoureux des procédures automatisées contribue à une plus grande fiabilité globale d’analyse pathologique murine. Plus précisément, ce protocole décrit l’utilisation d’un traitement automatisé et intégration de systèmes robotiques, couramment utilisées pour le traitement des tissus et enrobage de paraffine d’échantillons humains, pour traiter des spécimens murins d’inflammation intestinale. Nous concluons que la fiabilité de l’examen histopathologique des tissus murins est sensiblement augmentée lors de l’introduction de techniques standardisés et automatisés.

Colite chronique expérimentale induite par l’administration répétée de DSS dans l’eau potable est un modèle murin d’inflammation intestinale ressemblant humaine EIA8,9. La figure 1 décrit les effets du traitement de DSS, y compris le côlon raccourcissement (Figure 1 a), un paramètre utilisé pour marquer la présence de l’inflammation induite par le DSS et...

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Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Manque de normalisation pour le traitement des tissus murins réduit la qualité de l’analyse histopathologique murin par rapport aux spécimens humains. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’examen histopathologique des tissus coliques murines, enflammées et inflammθe, à démontrer la faisabilité des systèmes robotiques couramment utilisées pour le traitement et l’incorporation des échantillons humains.

À l’aide de systèmes robotiques pour traiter et intégrer coliques Murine échantillons pour Analyses histologiques

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Ce protocole automatisé permet la préparation histopathologique des tissus murins avec des systèmes robotiques couramment utilisés pour le traitement et l’intégration d’échantillons humains, augmentant considérablement la qualité des échantillons. Les principaux avantages de cette technique, c’est qu’elle réduit le nombre de variables méthodologiques et améliore la normalisation des étapes procédurales. Démontrer la procédure, sera Francesca Boggio.Francesca Boggio est pathologiste travaillant dans mon laboratoire. Commencez par utiliser de petites pinces à épiler pour transférer les échantillons fixes de tissu du côlon murin de la formaline tamponnée neutre, sur une plaque de travail de sectionnement dans une boîte de Pétri. Utilisez un scalpel stérile pour couper le côlon en fragments de 0,2 à 0,3 centimètre, et utilisez la pince à épiler pour placer un segment dans chacun des trois bouts non adjacents en plastique saillant d’une cassette orientée paraffine-intégration.Poussez soigneusement les quatre bords pour fermer la cassette et insérez la grille dans un cadre de soutien en plastique. Ensuite, étiquetez le cadre de soutien pour identifier l’échantillon et transférer la cassette dans la grille. Une heure avant le traitement, tournez le processeur automatisé.Lorsque l’instrument indique que la paraffine a fondu, insérez manuellement le panier métallique dans le processeur automatisé. Lorsque toutes les cassettes ont été insérées, fermez le panier et ouvrez le couvercle de la riposte. Insérez le panier dans le boîtier dédié du processeur et fermez le couvercle de la riposte.Utilisez l’écran tactile de l’ordinateur de l’instrument pour définir le protocole de travail en sélectionnant la séquence de solutions, le timing et la température, à implémenter selon le schéma fourni dans le tableau. Cliquez sur l’icône dédiée à l’ordinateur pour attribuer le protocole à la riposte contenant le panier de cassettes, et cliquez sur le bouton de démarrage. Lorsque l’instrument confirme la fin du protocole avec une icône dédiée et une tonalité d’alarme, ouvrez le couvercle de la riposte et retirez le panier du processeur.Une heure avant l’intégration du tissu, allumez l’embedder automatisé et attendez que la paraffine soit complètement fondue comme l’indique le thermomètre de bain paraffine de l’instrument. Transférez manuellement jusqu’à 32 cassettes traitées du panier du processeur à la grille d’enseil et ouvrez le couvercle principal de l’embedder. Utilisez l’écran tactile pour signaler au système robotique qu’un rack est inséré et ouvrir le couvercle du boîtier de l’entrée.Insérez jusqu’à quatre supports dans le boîtier de l’entrée et fermez le couvercle du boîtier. Ensuite, utilisez l’écran tactile pour démarrer la procédure d’intégration comme indiqué dans le tableau. Lorsque l’instrument confirme la fin du protocole avec l’icône dédiée, retirez le support de sortie et fermez le couvercle principal de l’embedder.Ensuite, transférez les blocs intégrés de la grille dans une boîte de stockage. Le raccourcissement du côlon, et l’expression du côlon des gènes pro-inflammatoires, sont des paramètres largement utilisés pour marquer la présence de sulfate de sodium dextran ou d’inflammation induite par le DSS. L’infiltration des cellules inflammatoires dans le propria intestinal de lamina est également considérablement augmentée par le traitement de DSS.La coloration H&E d’échantillons non traités traités par automatisation, telle qu’elle a été démontrée, révèle moins de cellules inflammatoires infiltrantes, d’altérations épithéliales et de changements dans l’architecture muqueuse par rapport aux échantillons prélevés sur des animaux traités par le MAS. La qualité de la préparation et de l’intégration des tissus murins effectuée par les instruments automatisés peut être confirmée en outre par la coloration immunohistochimique du CD20 et de la coloration trichrome mallory. Notamment, le traitement automatisé des échantillons permet systématiquement l’évaluation d’une proportion plus élevée de paramètres histologiques que les échantillons traités par la méthode manuelle.Prenez soin d’insérer correctement le tissu dans la grille pour attendre que le processeur automatisé soit prêt, et d’attendre que la paraffine soit complètement fondue. Cette méthode peut être utilisée pour effectuer l’analyse histologique de n’importe quel tissu murin, avec le qualitive des échantillons histologiques humains qui seront utilisés dans les modèles murins des pathologistes humains. Cette technique a déjà été une étude réussie pour l’étude de l’inflammation inflammatoire des tissus, et sera utile pour étudier les modèles de cancer colorectal de la murine.Comme certains reagents utilisés dans ce protocole sont dangereux, n’oubliez pas de toujours porter des gants de protection, des lunettes et un manteau de laboratoire lors de l’exécution de cette procédure.

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