Name: using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Ringraziamo il dipartimento di patologia dell'ospedale Policlinico IRCCS, Milano per il supporto tecnico e l'IEO Animal Facility per l'assistenza nel settore zootecnico.

Procedure di animali sono state approvate dal Ministero della salute (auth. 127/15 27/13) e seguivano le indicazioni di cura degli animali dell'Istituto europeo di oncologia IACUC (Comitato di uso e istituzionali Animal Care)
1. cronica colite induzione dall'amministrazione ripetitive DSS
<ol><li>Topi in 2 gruppi (trattamento DSS vs controllo H2O, almeno 5 littermates topi per ogni gruppo sperimentale) abbinati per età separata e sesso.</li>
	<li>Amministrare il 2,5% DSS (40 kDa)...

<ol>
	<li>Gibson-Corley, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+Integration+of+the+Histology+Core+Laboratory+in+Translational+Research.">Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research.</a> Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).</li><li>Olivier, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+species+in+research:+Opportunities+and+challenges+for+the+histology+core+laboratory.">Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory.</a> Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).</li><li>Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+valid+histopathologic+scoring+in+research.">Principles for valid histopathologic scoring in research.</a> Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).</li><li>Stolfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+interleukin-21+in+the+regulation+of+colitis-associated+colon+cancer.">Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).</li><li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development:+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research.">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li><li>Peters, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).</li><li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , (2011).</li><li>Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+mucosal+inflammation+and+their+relation+to+human+inflammatory+bowel+disease.">Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease.</a> Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature. 2, 541-546 (2007).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Cribi&#249;, F. M., Burrello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+automated+inclusion+system+for+the+histological+analysis+of+murine+tissue+samples:+A+feasibility+study+in+DSS-induced+chronic+colitis.">Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis.</a> European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).</li></ol>

Utilizziamo diversi passaggi automatizzati durante la preparazione dei tessuti murini per analisi istopatologica. Questo protocollo mira a fornire suggerimenti tecnici per incrementare la riproducibilità e la standardizzazione di tutto il processo, migliorando così la qualità complessiva della valutazione istopatologica finale. Abbiamo implementato strumenti automatizzati e metodi per la preparazione e l'incorporamento dei tessuti, abitualmente utilizzati in strutture di nucleo di patologia per lo studio di campioni u...

Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati diversi modelli sperimentali per sezionare i meccanismi patogenetici che portano a malattie umane1,2. Al fine di valutare la gravità di una malattia, i ricercatori devono valutare l'effetto di un trattamento e studiare le variazioni architettoniche citologiche ed istologiche o la quantità di infiammazione3. Per eseguire su tali modelli sperimentali, dettagliate analisi istopatologiche sono necessari, spesso confrontando campioni murine ed umane4,5.
Inoltre, campioni umani sono comunemente trattati e segnati da strutture di core di istopatologia e patologi esperti umani attraverso standardizzato criteri istopatologici e metodi. Al contrario, tessuti murini sono solitamente fisso, incorporate e analizzati dai ricercatori con esperienza limitata dei protocolli istopatologici. La qualità e l'affidabilità dell'esame istopatologico inizia con la preparazione di sezioni di tessuto di alta qualità. Diversi fattori contribuiscono criticamente per aumentare o diminuire la qualità dell'analisi finale, tra cui la fissazione, macroscopica di sezionamento, la lavorazione, paraffina embedding ed embedding dei campioni6,7.
Tutti questi passaggi che coinvolgono la manipolazione del campione sono soggetti a errori manuali, tra cui l'incorporamento manuale dei campioni e, in misura minore, microtomo manuale di taglio e colorazione. Allo stato attuale, l'intero processo di preparazione di tessuti murini per valutazione istologica si basa su protocolli che variano da laboratorio a laboratorio e i protocolli manuali. L'obiettivo di questo studio è quello di implementare protocolli standardizzati automatizzati per ridurre gli errori e variabilità nell'esame istopatologico murino.
A nostra conoscenza, descriviamo qui i primi protocolli per tessuto completamente automatizzato di elaborazione e incorporamento per la valutazione istologica dei tessuti murini; Questi sono abitualmente utilizzati nelle unità di patologia per le analisi di campioni umani. Come esempio pratico della fattibilità del metodo, è stato analizzato un modello murino di infiammazione intestinale, cioè, il modello di colite cronica causata da somministrazione ripetuta di Destrano solfato di sodio (DSS) in acqua potabile8 ,9. Questa impostazione sperimentale strettamente assomiglia umano infiammatorie intestinali (IBD) malattie10 poiché animali DSS-trattati mostrano segni di infiammazione intestinale, per esempio, perdita di peso, feci o diarrea e accorciamento del colon, nonché di fibrosi 8,9,11. Come osservato per i pazienti IBD umani, DSS trattamento genera un decorso della malattia complessa. In questo contesto, elaborare valutazioni istologiche sono tenuti a comprendere la profonda alterazione dell'architettura del tessuto. Così, l'implementazione di protocolli descritti per aumentare la qualità di preparazione del campione per la vostra comodità ricercatori basandosi sull'interpretazione di istologici e immunohistochemical analizza per impostazioni sperimentali murine. Modelli sperimentali murini di malattie umane che coinvolge alterazioni dell'architettura del tessuto, la presenza di tessuto cellulare si infiltra in o infiammazione in diversi tessuti e organi (cervello, fegato, intestino, pelle) potrebbe utilizzare l'incremento della qualità della preparazione del campione per esame istopatologico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414605</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ETOH</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Potassium Sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6435</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>415049</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbol Fuchsin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C4165</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (clone M1/70)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0112-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20 IHC (clone SA275A11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>150403</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (17A2)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0032-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (GK1.5)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552051</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 (clone 104)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109837</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 (53-6.7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer pH 6 10X</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C9999</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dab</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS</td>
			<td>TdB Consultancy</td>
			<td>DB001</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E9884</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Substrate</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex/HRP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex+ Rat Linker</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.09844</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 (clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>2,529,311,215</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>71251</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-Rat-HRP</td>
			<td>Agilent DAKO</td>
			<td>P0448</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>C0303</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Rotary microtome (RM2255)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g (clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury II Oxide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>203793</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis Clearify Clearing Agent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis EnVision Flex TRS</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>GV80011-2</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O3756</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>7052</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peloris</td>
			<td>LEICA</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4937</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without L-Glutamine</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0501-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STS020</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>7022</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Automated paraffin embedder</td>
			<td>Sakura</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>8080.1000</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses

La comprensione delle malattie umane è stata notevolmente ampliata grazie allo studio di modelli animali. Tuttavia, la valutazione istopatologica di modelli sperimentali deve essere così rigorosa come quella applicata per i campioni umani. Infatti, trarre conclusioni affidabili e accurate criticamente è influenzato dalla qualità della preparazione della sezione di tessuto. Qui, descriviamo un protocollo per l'analisi istopatologica dei tessuti murini che implementa diversi passaggi automatizzati durante la procedura, dalla preparazione iniziale per l'inclusione in paraffina dei campioni murini. La riduzione delle variabili metodologiche attraverso la standardizzazione del protocollo rigoroso da procedure automatizzate contribuisce alla maggiore affidabilità delle analisi patologica murino. In particolare, questo protocollo viene descritto l'utilizzo di trattamento automatizzato e l'incorporamento di sistemi robotici, abitualmente utilizzati per la lavorazione di tessuti e inclusione in paraffina di campioni umani, per elaborare murini esemplari di infiammazione intestinale. Concludiamo che l'affidabilità dell'esame istopatologico dei tessuti murini è aumentato significativamente dopo l'introduzione di tecniche standardizzate e automatizzate.

Colite cronica sperimentale indotta dalla somministrazione ripetuta di DSS nell'acqua potabile è un modello murino di infiammazione intestinale molto somiglianti umano IBD8,9. Figura 1 descrive gli effetti del trattamento di DSS, tra cui colon accorciamento (Figura 1A), un parametro ampiamente usato per segnare la presenza di infiammazione indotta da DSS e colica espress...

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Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Mancanza di standardizzazione per la processazione dei tessuti murini riduce la qualità delle analisi istopatologica murino rispetto agli esemplari umani. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l'esame istopatologico di murini tessuti infiammati e uninflamed colici a dimostrare la fattibilità di sistemi robotici abitualmente utilizzati per l'elaborazione e l'incorporamento di campioni umani.

Utilizzo di sistemi robotici per elaborare e incorporare colici murini campioni per le analisi istologiche

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Questo protocollo automatizzato consente la preparazione istopatologica dei tessuti murini con sistemi robotici abitualmente utilizzati per l'elaborazione e l'incorporamento di campioni umani, aumentando notevolmente la qualità dei campioni. I principali vantaggi di questa tecnica sono che riduce il numero di variabili metodologiche e migliora la standardizzazione delle fasi procedurali. A dimostrare la procedura, sarà Francesca Boggio.Francesca Boggio è una patologa che lavora nel mio laboratorio. Inizia usando piccole pinzette per trasferire i campioni fissi di tessuto del colon murino dalla formalina tamponata neutra, su una piastra di lavoro di sessatura in una piastra di Petri. Utilizzare un bisturi sterile per tagliare i due punti in frammenti da 0,2 a 0,3 centimetri e utilizzare le pinzette per posizionare un segmento in ciascuna delle tre punte sporgenti di plastica non adiacenti di una cassetta orientata per incorporare la paraffina.Spingere con cura i quattro bordi per chiudere la cassetta e inserire la griglia in un telaio di supporto in plastica. Quindi, etichettare il fotogramma di supporto per identificare il campione e trasferire la cassetta nella griglia. Un'ora prima dell'elaborazione, ruotare il processore automatico.Quando lo strumento indica che la paraffina si è sciolta, inserire manualmente il cestello metallico nel processore automatizzato. Una volta inserite tutte le cassette, chiudere il cestello e aprire il coperchio della ritocco. Inserire il cestello nell'alloggiamento dedicato del processore e chiudere il coperchio della ritocco.Utilizzare il touchscreen sul computer dello strumento per definire il protocollo di lavoro selezionando la sequenza di soluzioni, tempi e temperatura, da attuare secondo lo schema fornito nella tabella. Fare clic sull'icona del computer dedicato per assegnare il protocollo alla tordo contenente il carrello delle cassette e fare clic sul pulsante start. Quando lo strumento conferma la fine del protocollo con un'icona dedicata e un tono di allarme, aprire il coperchio della torsione e rimuovere il cestello dal processore.Un'ora prima dell'incorporamento del tessuto, accendere l'embedder automatico e attendere che la paraffina sia completamente sciolta come indicato dal termometro del bagno di paraffina sullo strumento. Trasferire manualmente fino a 32 cassette elaborate dal cestello del processore al rack dell'incorporatore e aprire il coperchio principale dell'embedder. Utilizzare il touchscreen per segnalare al sistema robotico che viene inserito un rack e aprire il coperchio dell'alloggiamento dell'ingresso.Inserire fino a quattro rack nell'alloggiamento di ingresso e chiudere il coperchio dell'alloggiamento dell'ingresso. Quindi, utilizzare il touchscreen per avviare la procedura di incorporamento come indicato nella tabella. Quando lo strumento conferma l'estremità del protocollo con l'icona dedicata, rimuovere il rack di uscita e chiudere il coperchio principale dell'embedder.Quindi, trasferire i blocchi incorporati dal rack in una scatola di archiviazione. L'accorciamento del colon e l'espressione colon dei geni pro infiammatori sono parametri ampiamente utilizzati per segnare la presenza di solfato di sodio di dextran o infiammazione indotta da DSS. Anche l'infiltrazione di cellule infiammatorie nella lamina propria intestinale è notevolmente migliorata dal trattamento DSS.La colorazione H&E di campioni non trattati elaborati dall'automazione come dimostrato, rivela meno cellule infiammatorie infiltrazioni, alterazioni epiteliali e cambiamenti nell'architettura delle mucose rispetto ai campioni di animali trattati con DSS. La qualità della preparazione e dell'incorporamento del tessuto murino eseguita dagli strumenti automatizzati può essere ulteriormente confermata dalla colorazione immunoistochimica per CD20 e Colorazione Tricromatica Mallory. In particolare, l'elaborazione automatizzata dei campioni consente costantemente la valutazione di una percentuale più elevata di parametri istologici rispetto ai campioni elaborati con il metodo manuale.Fare attenzione a inserire correttamente il tessuto nella griglia per attendere che il processore automatizzato sia pronto e attendere che la paraffina sia completamente sciolta. Questo metodo può essere utilizzato per eseguire analisi istologiche di qualsiasi tessuto murino, con la qualitazione di campioni istologici umani che saranno utilizzati nei modelli murini dei patologi umani. Questa tecnica ha già avuto successo nello studio per lo studio dell'infiammazione infiammatoria dei tessuti e sarà utile per studiare modelli di cancro murino colorettale.Poiché alcuni reagenti utilizzati in questo protocollo sono pericolosi, ricorda di indossare sempre guanti protettivi, occhiali e un camice da laboratorio quando esegui questa procedura.

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