Name: using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Agradecemos ao departamento de patologia do Hospital Policlínico IRCCS, Milão para suporte técnico e a facilidade de Animal OIE para assistência na pecuária.

Procedimentos de animais foram aprovados pelo Ministério da saúde (auth. 127/15, 27/13) italiano e seguiram as orientações de cuidados com animais do Instituto Europeu de Oncologia IACUC (Comité de uso e cuidados institucionais do Animal)
1. crônica colite indução pela administração repetitiva de DSS
<ol><li>Idade separada e sexo combinam ratos em 2 grupos (tratamento DSS vs controle de H2O, pelo menos 5 littermates ratos por grupo experimental).</li>
	<li>Administrar 2,...

<ol>
	<li>Gibson-Corley, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+Integration+of+the+Histology+Core+Laboratory+in+Translational+Research.">Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research.</a> Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).</li><li>Olivier, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+species+in+research:+Opportunities+and+challenges+for+the+histology+core+laboratory.">Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory.</a> Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).</li><li>Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+valid+histopathologic+scoring+in+research.">Principles for valid histopathologic scoring in research.</a> Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).</li><li>Stolfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+interleukin-21+in+the+regulation+of+colitis-associated+colon+cancer.">Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).</li><li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development:+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research.">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li><li>Peters, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).</li><li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , (2011).</li><li>Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+mucosal+inflammation+and+their+relation+to+human+inflammatory+bowel+disease.">Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease.</a> Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature. 2, 541-546 (2007).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Cribi&#249;, F. M., Burrello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+automated+inclusion+system+for+the+histological+analysis+of+murine+tissue+samples:+A+feasibility+study+in+DSS-induced+chronic+colitis.">Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis.</a> European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).</li></ol>

Nós utilizamos diferentes etapas automatizadas durante a preparação dos tecidos murino para análise histopatológica. Este protocolo visa proporcionar dicas técnicas para aumentar a reprodutibilidade e a padronização de todo o processo, melhorando assim a qualidade geral da avaliação histopatológica final. Implementamos automatizado de instrumentos e métodos para a preparação e a incorporação de tecidos, rotineiramente utilizados em instalações de núcleo de patologia para o estudo de espécimes humanos....

Nas últimas décadas, vários modelos experimentais foram desenvolvidos para dissecar os mecanismos patogénicos, levando a doenças humanas1,2. Para avaliar a gravidade de uma doença, os pesquisadores devem avaliar o efeito de um tratamento e estudar as variações de arquiteturais citológicas e histológicas ou a quantidade de inflamação3. Para executar esses modelos experimentais, detalhadas análises histopatológicas são necessários, muitas vezes comparando amostras de murino e humano4,5.
Além disso, amostras humanas são comumente processadas e marcou pelas instalações do núcleo de histopatologia e padronizado de experientes patologistas humanos através de critérios histopatológicos e métodos. Por outro lado, murino tecidos são geralmente fixa, incorporados e analisados por pesquisadores com experiência limitada de protocolos histopatológicos. A qualidade e a confiabilidade do exame histopatológico começa com a preparação de cortes de tecido de alta qualidade. Criticamente, vários fatores contribuem para aumentar ou diminuir a qualidade da análise final, incluindo fixação, macroscópica de seccionamento, processamento, parafina incorporação e incorporação de amostras6,7.
Todas estas passagens envolvendo a manipulação da amostra estão sujeitos a erros manuais, incluindo incorporação manual das amostras e, em menor medida, micrótomo manual de corte e coloração. Neste momento, todo o processo de preparação do tecido murino para avaliação histológica baseia-se nos protocolos manuais e protocolos que variam de laboratório para laboratório. O objetivo deste estudo é implementar protocolos padronizados de automatizado para reduzir erros e variabilidade no exame histopatológico murino.
A nosso conhecimento, nós descrevemos aqui primeiros protocolos para tecido totalmente automatizado de processamento e incorporação para a avaliação histológica dos tecidos murino; Estes são rotineiramente utilizados em unidades de patologia para as análises de amostras humanas. Como um exemplo prático da viabilidade do método, um modelo murino de inflamação intestinal foi analisado, ou seja,, o modelo de colite crônica causada pela administração repetida de sulfato de dextrano de sódio (DSS) na água bebendo8 ,9. Esta configuração experimental de perto se assemelha a humana inflamatória intestinal (IBD) de doenças10 desde que os animais tratados com DSS exibem sinais de inflamação intestinal, por exemplo, perda de peso, fezes soltas ou diarreia e encurtamento do cólon, bem como fibrose 8,9,11. Como observado para pacientes humanos IBD, tratamento de DSS gera um curso de doenças complexas. Neste contexto, elaboradas avaliações histológicas são necessários para compreender a profunda alteração da arquitetura do tecido. Assim, a implementação dos protocolos descritos para o aumento da qualidade de preparação de amostra pode beneficiar pesquisadores baseando-se na interpretação do histológico e imuno-histoquímica analisa para configurações experimentais murino. Murino modelos experimentais de doenças humanas que envolvem alterações da arquitetura do tecido, a presença de infiltrado de tecido celular ou inflamação em diferentes tecidos e órgãos (intestino, cérebro, fígado, pele) pode usar o aumento da qualidade da preparação da amostra para exame histopatológico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414605</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ETOH</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Potassium Sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6435</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>415049</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbol Fuchsin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C4165</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (clone M1/70)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0112-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20 IHC (clone SA275A11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>150403</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (17A2)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0032-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (GK1.5)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552051</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 (clone 104)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109837</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 (53-6.7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer pH 6 10X</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C9999</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dab</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS</td>
			<td>TdB Consultancy</td>
			<td>DB001</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E9884</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Substrate</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex/HRP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex+ Rat Linker</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.09844</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 (clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>2,529,311,215</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>71251</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-Rat-HRP</td>
			<td>Agilent DAKO</td>
			<td>P0448</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>C0303</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Rotary microtome (RM2255)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g (clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury II Oxide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>203793</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis Clearify Clearing Agent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis EnVision Flex TRS</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>GV80011-2</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O3756</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>7052</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peloris</td>
			<td>LEICA</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4937</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without L-Glutamine</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0501-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STS020</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>7022</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Automated paraffin embedder</td>
			<td>Sakura</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>8080.1000</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses

A compreensão de doenças humanas foi grandemente ampliada graças ao estudo de modelos animais. Não obstante, avaliação histopatológica de modelos experimentais precisa ser tão rigoroso que o aplicado para amostras humanas. Com efeito, conclusões confiáveis e precisos criticamente é influenciado pela qualidade da preparação de secção de tecido. Aqui, descrevemos um protocolo para análise histopatológica de tecidos murino que implementa várias etapas automatizadas durante o procedimento, desde a preparação inicial para a incorporação de parafina das amostras murino. A redução de variáveis metodológicas através de padronização de protocolo rigoroso de procedimentos automatizados contribui para maior confiabilidade global de murino análise patológica. Especificamente, este protocolo descreve a utilização de processamento automatizado e incorporando sistemas robóticos, rotineiramente utilizado no processamento do tecido e parafina incorporação de amostras humanas, para processar amostras murino de inflamação intestinal. Podemos concluir que a confiabilidade do exame histopatológico de tecidos murino é significativamente maior em cima da introdução de técnicas padronizadas e automatizadas.

Colite crônica experimental, induzida pela administração repetida de DSS na água potável é um modelo murino de inflamação intestinal, muito parecidos com humanos IBD8,9. A Figura 1 descreve os efeitos do tratamento de DSS, incluindo cólon encurtamento (figura 1A), um parâmetro utilizado para marcar a presença de inflamação induzida por DSS e Colônica express...

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Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Falta de padronização para processamento do tecido murino reduz a qualidade da análise histopatológica murino em comparação com espécimes humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o exame histopatológico dos tecidos do cólon inflamados e uninflamed murino para mostrar a viabilidade de sistemas robóticos rotineiramente utilizados para processamento e incorporação de amostras humanas.

Usando sistemas robóticos para processar e incorporar Colônica murino amostras para análise histológica

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Este protocolo automatizado permite a preparação histopatológica de tecidos murinos com sistemas robóticos rotineiramente utilizados para processamento e incorporação de amostras humanas, aumentando consideravelmente a qualidade das amostras. As principais vantagens dessa técnica, são que ela reduz o número de variáveis metodológicas e melhora a padronização das etapas processuais. Demonstrando o procedimento, será Francesca Boggio.Francesca Boggio é uma patologista trabalhando no meu laboratório. Comece usando pequenas pinças para transferir as amostras fixas de tecido de cólon murino da formalina tamponada neutra, para uma placa de trabalho de secção em uma placa de Petri. Use um bisturi estéril para cortar o cólon em fragmentos de 0,2 a 0,3 centímetros, e use a pinça para colocar um segmento em cada um dos três pontas de plástico não adjacentes de um orientado para incorporação de parafina.Empurre cuidadosamente as quatro bordas para fechar o e inserir a grade em uma estrutura de suporte de plástico. Em seguida, rotule o quadro de suporte para identificar a amostra e transfira o para a grade. Uma hora antes do processamento, gire o processador automatizado.Quando o instrumento indicar que a parafina derreteu, insira manualmente a cesta de metal no processador automatizado. Quando todas as fitas estiverem inseridas, feche a cesta e abra a tampa da réplica. Insira a cesta na carcaça dedicada do processador e feche a tampa da réplica.Use a tela sensível ao toque no computador de instrumentos para definir o protocolo de trabalho selecionando a sequência de soluções, tempo e temperatura, a serem implementadas de acordo com o esquema fornecido na tabela. Clique no ícone dedicado do computador para atribuir o protocolo à réplica contendo a cesta de e clique no botão iniciar. Quando o instrumento confirmar o fim do protocolo com um ícone dedicado e um tom de alarme, abra a tampa da réplica e remova a cesta do processador.Uma hora antes da incorporação do tecido, ligue o incorporador automatizado e espere até que a parafina seja completamente derretida, como indicado pelo termômetro do banho de parafina no instrumento. Transfira manualmente até 32 fitas processadas da cesta do processador para o rack do embedder e abra a tampa principal do embedder. Use a tela sensível ao toque para sinalizar ao sistema robótico que um rack está sendo inserido e abrir a tampa da carcaça da entrada.Insira até quatro racks na carcaça da entrada e feche a tampa da carcaça da entrada. Em seguida, use a tela sensível ao toque para iniciar o procedimento de incorporação, conforme indicado na tabela. Quando o instrumento confirmar o fim do protocolo com o ícone dedicado, remova o rack de saída e feche a tampa principal do embedder.Em seguida, transfira os blocos incorporados do rack para uma caixa de armazenamento. Encurtamento de cólon, e expressão cólon de genes pro inflamatórios, são parâmetros amplamente utilizados para marcar a presença de sulfato de sódio dextran ou inflamação induzida pelo DSS. A infiltração de células inflamatórias na lavíria intestinal também é muito melhorada pelo tratamento de DSS.A coloração de H&E de amostras não tratadas processadas pela automação como demonstrado, revela menos células inflamatórias infiltradas, alterações epiteliais e alterações na arquitetura mucosa em comparação com amostras de animais tratados com DSS. A qualidade da preparação e incorporação do tecido murino realizado pelos instrumentos automatizados pode ser confirmada adicionalmente pela coloração imunohistoquímica para CD20 e Mallory Trichrome Staining. Notavelmente, o processamento automatizado de amostras permite consistentemente a avaliação de uma proporção maior de parâmetros histológicos do que as amostras processadas pelo método manual.Tome cuidado para inserir corretamente o tecido na grade para esperar que o processador automatizado esteja pronto, e esperar que a parafina seja completamente derretida. Este método pode ser usado para realizar análise histológica de qualquer tecido murino, com o qualitivo de amostras histológicas humanas que serão utilizadas em modelos murinos de patologistas humanos. Esta técnica já foi bem sucedida no estudo para o estudo da inflamação do tecido inflamatório, e será útil para estudar modelos de câncer colorretal de murina.Como alguns reagentes usados neste protocolo são perigosos, lembre-se de sempre usar luvas de proteção, óculos e um jaleco ao realizar este procedimento.

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