Name: using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses at JoVE.com

Мы благодарим Департамент патологии больницы Поликлинико IRCCS, Милан для технической поддержки и НОО животных фонда для оказания помощи в животноводстве.

Животных процедуры были одобрены министерством здравоохранения (авт. 127/15, 27/13) Италии и руководящими животных ухода Европейского института онкологии IACUC (институциональный уход за животными и использования Комитета)
1. хронический колит индукции администрацией повторяющ...

<ol>
	<li>Gibson-Corley, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+Integration+of+the+Histology+Core+Laboratory+in+Translational+Research.">Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research.</a> Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).</li><li>Olivier, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+species+in+research:+Opportunities+and+challenges+for+the+histology+core+laboratory.">Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory.</a> Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).</li><li>Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+valid+histopathologic+scoring+in+research.">Principles for valid histopathologic scoring in research.</a> Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).</li><li>Stolfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+interleukin-21+in+the+regulation+of+colitis-associated+colon+cancer.">Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).</li><li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development:+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research.">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li><li>Peters, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).</li><li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , (2011).</li><li>Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+mucosal+inflammation+and+their+relation+to+human+inflammatory+bowel+disease.">Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease.</a> Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature. 2, 541-546 (2007).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Cribi&#249;, F. M., Burrello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+automated+inclusion+system+for+the+histological+analysis+of+murine+tissue+samples:+A+feasibility+study+in+DSS-induced+chronic+colitis.">Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis.</a> European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).</li></ol>

Мы используем различные автоматизированные действия во время подготовки мышиных тканей для гистопатологические анализа. Этот протокол направлен на обеспечение технического Советы увеличить воспроизводимость и стандартизации процесса в целом, повышая тем самым общее качество оконч...

В последние десятилетия были разработаны несколько экспериментальных моделей вскрыть патогенетических механизмов, ведущих к заболеваний человека1,2. Для того чтобы оценить тяжесть заболевания, исследователи должны оценивать эффект от лечения и исследования цитологического и гистологического архитектурных изменений или количество воспаления3. Для выполнения этих экспериментальных моделей, необходимы подробные анализы гистопатологические, часто сравнивая мышиных и человеческих образцов4,5.
Кроме того людские пробы обычно обрабатываются и забил гистопатология основной зал и опытных человека патологоанатомов через стандартизированные гистопатологические критерии и методы. И наоборот мышиных ткани обычно фиксированной, встроенные и проанализированы исследователями с ограниченным опытом гистопатологические протоколов. Качество и надежность гистопатологические осмотра начинается с подготовки разделов ткани высокого качества. Несколько факторов способствуют критически увеличение или уменьшение, качество окончательного анализа, включая фиксацию, макроскопической секционирование, переработка, парафин встраивание и встраивание образцы6,7.
Все эти проходы с участием манипуляции образца подвергаются ручной ошибок, в том числе ручного встраивания образцов и, в меньшей степени, ручной правки микротомных секционирование и пятнать. В настоящее время весь процесс подготовки мышиных тканей для гистологического оценки опирается на протоколы, которые варьируются от лаборатории для лабораторных и ручной протоколов. Цель этого исследования заключается в реализации стандартных автоматизированных протоколов для уменьшения ошибок и изменчивости в мышиных гистопатологические экспертизы.
Насколько нам известно мы опишем здесь первые протоколы для полностью автоматизированной ткани обработки и внедрение оценки гистологических мышиных тканей; Обычно они используются в патологии подразделений для анализа человеческих особей. Как практический пример возможности метода, проанализировано модель мышиных кишечного воспаления, т.е., модель хронический колит вызванные повторного отправления декстран сульфата натрия (DSS) в питьевой воде8 ,9. Эта экспериментальная установка тесно напоминает человека воспалительных кишечника (IBD) заболеваний10 , поскольку DSS-лечить животных проявлять признаки кишечной воспаления, например, потеря веса, жидкий стул или понос и укорочение толстой кишки, а также фиброз 8,9,11. Как заметил человека IBD пациентов, DSS лечения создает сложное заболевание курс. В этом контексте сложных гистологических оценок необходимо понять глубокие изменения архитектуры ткани. Таким образом осуществление описанных протоколов для повышения качества подготовки образца может пользу исследователи, опираясь на интерпретации гистологические и иммуногистохимическое анализирует мышиных экспериментальных параметров. Мышиных экспериментальных моделях заболеваний человека с участием изменения архитектуры ткани, присутствие клетчатки инфильтрат или воспаление в различных тканях и органах (ЖКТ, мозга, печени, кожи) может использовать увеличение качества Пробоподготовка для гистопатологические осмотра.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414605</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ETOH</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Potassium Sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6435</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>415049</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbol Fuchsin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C4165</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (clone M1/70)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0112-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20 IHC (clone SA275A11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>150403</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (17A2)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0032-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (GK1.5)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552051</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 (clone 104)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109837</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 (53-6.7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer pH 6 10X</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C9999</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dab</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS</td>
			<td>TdB Consultancy</td>
			<td>DB001</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E9884</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Substrate</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex/HRP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex+ Rat Linker</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.09844</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 (clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>2,529,311,215</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>71251</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-Rat-HRP</td>
			<td>Agilent DAKO</td>
			<td>P0448</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>C0303</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Rotary microtome (RM2255)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g (clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury II Oxide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>203793</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis Clearify Clearing Agent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis EnVision Flex TRS</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>GV80011-2</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O3756</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>7052</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peloris</td>
			<td>LEICA</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4937</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without L-Glutamine</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0501-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STS020</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>7022</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Automated paraffin embedder</td>
			<td>Sakura</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>8080.1000</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses

Понимание человеческих заболеваний были значительно расширены благодаря изучению животных моделей. Тем не менее гистопатологические оценки экспериментальных моделей должен быть жестким, что применяется для человеческих образцов. Действительно надежные и точные выводы критически зависит от качества ткани секции подготовки. Здесь мы описываем протокол для гистопатологические анализа мышиных тканей, который реализует несколько автоматизированных шагов во время процедуры, от первоначальной подготовки для встраивания парафин мышиных образцов. Сокращение методологических переменных путем стандартизации строгий протокол от автоматизированных процедур способствует увеличению общей надежности мышиных патологических анализа. В частности этот протокол описывает использование автоматизированной обработки и внедрение робототехнических систем, обычно используются для обработки тканей и парафин встраивание человеческих образцов, для обработки мышиных образцы кишечные воспаления. Мы делаем вывод, что после внедрения стандартизированных и автоматизированных методов значительно повышена надежность гистопатологические осмотра мышиных тканей.

Экспериментальная хронический колит, вызванных повторного отправления DSS в питьевой воде является моделью мышиных кишечного воспаления, напоминающий человека IBD8,9. Рисунок 1 описывает эффекты лечения DSS, включая двоеточ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses at JoVE.com

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Отсутствие стандартизации для обработки мышиных ткани уменьшает качество мышиных гистопатологические анализа по сравнению с человеческих особей. Здесь мы представляем протокол для выполнения гистопатологические экспертизы мышиных воспаленной и рифамицин толстой тканей чтобы показать возможности робототехнических систем, обычно используются для обработки и встраивание человеческих образцов.

С помощью роботизированных систем для обработки и внедрить толстой мышиных проб для гистологического анализа

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Этот автоматизированный протокол позволяет гистопатологическо готовить ткани мурина с роботизированными системами, регулярно используемыми для обработки и встраивания образцов человека, что значительно повышает качество образцов. Основными преимуществами этого метода являются то, что он уменьшает количество методологических переменных и улучшает стандартизацию процедурных шагов. Демонстрация процедуры, будет Франческа Боггио.Франческа Боггио - патологоанатом, работающая в моей лаборатории. Начните с использования небольших пинцетов для передачи фиксированных образцов ткани толстой кишки мурина из нейтрального буферного формалина, на секционую рабочую пластину в чашке Петри. Используйте стерильный скальпель, чтобы разрезать толстой кишки на 0,2 до 0,3 сантиметра фрагментов, и использовать пинцет, чтобы поместить один сегмент в каждом из трех не прилегающих пластиковых выступающие кончики ориентированного парафина встраивания кассеты.Аккуратно нажмите четыре края, чтобы закрыть кассету и вставить сетку в пластиковую поддерживающую раму. Затем наклеить на нее вспомогательную рамку для идентификации образца и передачи кассеты в сетку. За час до обработки поверните автоматизированный процессор.Когда прибор указывает на то, что парафин расплавился, вручную вставьте металлическую корзину в автоматизированный процессор. Когда все кассеты были вставлены, закройте корзину и откройте крышку реторты. Вставьте корзину в специальное корпус процессора и закройте крышку реторты.Используйте сенсорный экран на приборной компьютере для определения рабочего протокола, определяя последовательность решений, сроки и температуру, которые должны быть реализованы в соответствии с схемой, представленной в таблице. Нажмите на специальный значок компьютера, чтобы назначить протокол на реторту, содержащую кассетную корзину, и нажмите кнопку "Пуск". Когда прибор подтвердит конец протокола выделенным значком и сигналом тревоги, откройте крышку реторты и удалите корзину из процессора.За час до встраивания ткани включите автоматизированный встраиваемый прибор и подождите, пока парафин полностью расплавится, как указано на термометре парафиновой ванны на приборе. Вручную перенесите до 32 обработанных кассет из корзины процессоров в встраиваемую стойку и откройте крышку основного встраиваемого встраиваемого. Используйте сенсорный экран, чтобы сигнализировать роботизированной системе, что стойка вставляется и открыть крышку вставки жилья.Вставьте до четырех стой в входе жилья и закрыть крышку вставки жилья. Затем используйте сенсорный экран для запуска процедуры встраивания, как указано в таблице. Когда прибор подтвердит конец протокола с выделенным значком, снимите стойку розетки и закройте крышку основного встраиваемого.Затем перенесите встроенные блоки из стойки в ящик для хранения. Сокращение толстой кишки, и толстой кишки экспрессии провоспалительных генов, широко используются параметры для скоринга наличие декстрана сульфата натрия или DSS индуцированного воспаления. Инфильтрация воспалительных клеток в кишечные ламина проприя также значительно усиливается путем лечения DSS.H и E окрашивание необработанных образцов, обработанных автоматизацией, как попродемонстрировано, показывает меньше проникающих воспалительных клеток, эпителиальных изменений и изменений в слизистой архитектуре по сравнению с образцами из DSS обработанных животных. Качество подготовки и встраивания ткани мурина, выполняемого автоматизированными приборами, может быть дополнительно подтверждено иммуногистохимическим окрашиванием для CD20 и Мэллори Трихромного окрашивания. Примечательно, что автоматизированная обработка образцов последовательно позволяет работать с более высокой долей гистологических параметров, чем образцы, обработанные ручным методом.Позаботьтесь, чтобы правильно вставить ткань в сетку, чтобы ждать автоматизированного процессора, чтобы быть готовым, и ждать парафина, чтобы полностью расплавиться. Этот метод может быть использован для выполнения гистологического анализа любой ткани мурина, с qualitive человеческих гистологических образцов, которые будут использоваться в муриновых моделях человека патологоанатомов. Этот метод уже успешно изучается для изучения воспаления воспалительных тканей, и будет полезен для изучения моделей колоректального рака мурина.Поскольку некоторые реагенты, используемые в этом протоколе, опасны, не забудьте всегда носить защитные перчатки, очки и лабораторное пальто при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Определение концентрации вируса через бляшки Анализы: используя традиционные и новейшие системы Наложение

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Быстрой стратегия для выделения новых Faustoviruses из проб окружающей среды Использование<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Мышиной модели группы B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Вагинальный Колонизация

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Бронхоальвеолярное спазмы легких у мышей для анализа воспалительной клеточной инфильтрации

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Гистологические количественная оценка для определения в экспериментальной аспергиллез легких грибковых бремя

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Глубокий дермальный инъекции как модель кожи инфекции Candida albicans для гистологического анализа

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...