Name: using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses at JoVE.com

Agradecemos al Departamento de patología del IRCCS Policlinico Hospital, Milan para el soporte técnico y la facilidad de Animal de IEO para asistencia en la ganadería.

Procedimientos animales fueron aprobados por el Ministerio de salud (auth. 127/15, 27/13) y siguieron las pautas de cuidado de los animales del Instituto Europeo de Oncología IACUC (Comité de uso y cuidado Animal institucional)
1. crónica Colitis inducción administración de DSS repetitivas
<ol><li>Independiente edad y sexo igualada ratones en 2 grupos (DSS tratamiento vs control H2O, al menos 5 hermanos de camada de ratones por grupo experimental).</li>
	<li>Administrar 2.5% ...

<ol>
	<li>Gibson-Corley, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+Integration+of+the+Histology+Core+Laboratory+in+Translational+Research.">Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research.</a> Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).</li><li>Olivier, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+species+in+research:+Opportunities+and+challenges+for+the+histology+core+laboratory.">Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory.</a> Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).</li><li>Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+valid+histopathologic+scoring+in+research.">Principles for valid histopathologic scoring in research.</a> Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).</li><li>Stolfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+interleukin-21+in+the+regulation+of+colitis-associated+colon+cancer.">Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).</li><li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development:+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research.">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li><li>Peters, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).</li><li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , (2011).</li><li>Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+mucosal+inflammation+and+their+relation+to+human+inflammatory+bowel+disease.">Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease.</a> Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature. 2, 541-546 (2007).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Cribi&#249;, F. M., Burrello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+automated+inclusion+system+for+the+histological+analysis+of+murine+tissue+samples:+A+feasibility+study+in+DSS-induced+chronic+colitis.">Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis.</a> European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).</li></ol>

Utilizamos diferentes pasos automatizados durante la preparación de tejidos murinos para análisis histopatológico. Este protocolo tiene como objetivo brindar consejos técnicos para aumentar la reproducibilidad y la estandarización de todo el proceso, mejorando así la calidad de la evaluación histopatológica definitiva. Implementamos instrumentos automatizados y métodos para la preparación y fijación de los tejidos, habitualmente utilizados en las instalaciones de base de patología para el estudio de especíme...

En las últimas décadas, se han desarrollado varios modelos experimentales para diseccionar los mecanismos patogénicos que conducen a enfermedades humanas1,2. Para evaluar la severidad de una enfermedad, los investigadores deben evaluar el efecto de un tratamiento y estudiar las variaciones citológicas e histológicas arquitectónicas o la cantidad de inflamación3. Para realizar en los modelos experimentales, son necesarios los análisis histopatológicos detallados, a menudo comparando muestras murino y humano4,5.
Además, muestras humanas comúnmente son procesadas y anotó por las instalaciones del núcleo de histopatología y patólogos experimentados humanos a través de estandardizado métodos y criterios histopatológicos. Por el contrario, tejidos murinos son generalmente fijos, incrustados y analizados por los investigadores con experiencia limitada de protocolos histopatológicos. La calidad y fiabilidad de la examinación histopatológica comienza con la preparación de las secciones de tejido de alta calidad. Varios factores contribuyen críticamente al aumento o disminución de la calidad de definitiva, incluyendo fijación, macroscópica seccionamiento, procesamiento, de parafina inclusión, inclusión de las muestras6,7.
Todos estos pasajes que implican manipulación de la muestra están sujetos a errores manuales, incluyendo la inclusión manual de las muestras y, en menor medida, microtomo manual corte y tinción. En la actualidad, todo el proceso de preparación de tejido murino para la evaluación histológica se basa en protocolos manual y protocolos que varían de laboratorio a laboratorio. El objetivo de este estudio es implementar protocolos estandarizados automatizados para reducir errores y variabilidad en la examinación histopatológica murina.
A nuestro conocimiento, Describimos aquí los primeros protocolos de tejido completamente automatizado de procesamiento y embebido para la evaluación histológica de los tejidos murinos; Estos se utilizan habitualmente en las unidades de patología para el análisis de muestras humanas. Como un ejemplo práctico de la viabilidad del método, un modelo murino de inflamación intestinal ha sido analizado, es decir,, el modelo de colitis crónica causada por la administración repetida de sulfato de sodio de dextrano (DSS) en el agua potable8 ,9. Este ajuste experimental de cerca se asemeja a humano inflamatoria intestinal (EII) las enfermedades10 puesto que animales tratados con DSS exhiben signos de inflamación intestinal, por ejemplo, pérdida de peso, heces sueltas o diarrea y acortamiento del colon, así como fibrosis 8,9,11. Como observado en pacientes humanos con enfermedad inflamatoria intestinal, tratamiento de DSS genera un curso de la enfermedad compleja. En este contexto, elaboradas evaluaciones histológicas están obligadas a entender la profunda alteración de la arquitectura del tejido. Así, la aplicación de los protocolos descritos para aumentar la calidad de preparación de la muestra podría beneficiarse los investigadores basándose en la interpretación de histológicos y análisis immunohistochemical para la configuración experimental murino. Modelos experimentales murinos de enfermedades humanas que implican alteraciones de la arquitectura del tejido, la presencia de infiltrado de tejido celular o inflamación de diferentes tejidos y órganos (intestino, cerebro, hígado, piel) puede utilizar el aumento de la calidad de la preparación de muestras para examen histopatológico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414605</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ETOH</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Potassium Sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6435</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>415049</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbol Fuchsin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C4165</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (clone M1/70)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0112-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20 IHC (clone SA275A11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>150403</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (17A2)</td>
			<td>TONBO biosciences</td>
			<td>35-0032-U100</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (GK1.5)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552051</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 (clone 104)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109837</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 (53-6.7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553031</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer pH 6 10X</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C9999</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dab</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS</td>
			<td>TdB Consultancy</td>
			<td>DB001</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E9884</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex Substrate</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex/HRP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Flex+ Rat Linker</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>compreso in GV80011-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.09844</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 (clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123108</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>2,529,311,215</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>71251</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-Rat-HRP</td>
			<td>Agilent DAKO</td>
			<td>P0448</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>C0303</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Rotary microtome (RM2255)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g (clone 1A8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551459</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury II Oxide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>203793</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis Clearify Clearing Agent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnis EnVision Flex TRS</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>GV80011-2</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O3756</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>7052</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peloris</td>
			<td>LEICA</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4937</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 without L-Glutamine</td>
			<td>Microgem</td>
			<td>L0501-500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STS020</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>7022</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Automated paraffin embedder</td>
			<td>Sakura</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>8080.1000</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using robotic systems to process and embed colonic murine samples for histological analyses

La comprensión de enfermedades humanas se ha ampliado considerablemente gracias al estudio de modelos animales. Sin embargo, la evaluación histopatológica de modelos experimentales debe ser tan riguroso como el que aplica para muestras humanas. De hecho, extraer conclusiones fiables y precisas críticamente está influenciada por la calidad de la preparación de la sección de tejido. Aquí, describimos un protocolo para el análisis histopatológico de los tejidos murinos que implementa varios pasos automatizados durante el procedimiento, desde la preparación inicial para la inclusión en parafina de las muestras murinas. La reducción de variables metodológicas mediante la estandarización de protocolo riguroso de procedimientos automatizados contribuye al aumento de la fiabilidad global del análisis patológico murino. Específicamente, este protocolo describe la utilización de tratamiento automatizado e incorporar sistemas robóticos, utilizado habitualmente para el proceso de tejido y la inclusión en parafina de muestras humanas, para procesar a muestras murinas de inflamación intestinal. Concluimos que la fiabilidad de la examinación histopatológica de los tejidos murinos se aumentó significativamente con la introducción de técnicas estandarizadas y automatizadas.

La colitis crónica experimental inducida por la administración repetida de DSS en el agua potable es un modelo murino de inflamación intestinal muy parecidas a la humana EII8,9. La figura 1 describe los efectos del tratamiento de DSS, incluyendo colon acortar (figura 1A), un parámetro utilizado para anotar la presencia de la inflamación inducida por DSS y colon expre...

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Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

Falta de estandarización para el procesamiento de tejido murino reduce la calidad del análisis histopatológico murino en comparación con los especímenes humanos. Aquí, presentamos un protocolo para realizar el examen histopatológico de tejidos colon inflamados y uninflamed murinos para demostrar la viabilidad de sistemas robóticos que se utilizan habitualmente para el tratamiento y la inclusión de muestras humanas.

Uso de sistemas robóticos para procesar e integrar colónicas murinas muestras para análisis histológicos

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Este protocolo automatizado permite la preparación histopatológica de tejidos murino con sistemas robóticos utilizados habitualmente para el procesamiento e incrustación de muestras humanas, aumentando en gran medida la calidad de las muestras. Las principales ventajas de esta técnica, son que reduce el número de variables metodológicas y mejora la estandarización de los pasos procesales. Demostrando el procedimiento, será Francesca Boggio.Francesca Boggio es una patóloga que trabaja en mi laboratorio. Comience usando pequeñas pinzas para transferir las muestras fijas de tejido del colon murino de la formalina tamponada neutra, a una placa de trabajo de seccionamiento en una placa de Petri. Usa un bisturí estéril para cortar el colon en fragmentos de 0,2 a 0,3 centímetros, y usa las pinzas para colocar un segmento en cada una de las tres puntas de plástico no adyacentes que sobresalen de un cassette orientado a la incrustación de parafina.Empuje cuidadosamente los cuatro bordes para cerrar el cassette e inserte la rejilla en un marco de soporte de plástico. A continuación, etiquete el marco de soporte para identificar la muestra y transfiera el cassette a la cuadrícula. Una hora antes del procesamiento, gire el procesador automatizado.Cuando el instrumento indique que la parafina se ha derretido, inserte manualmente la cesta metálica en el procesador automatizado. Cuando se hayan insertado todos los cassettes, cierre la cesta y abra la tapa de la réplica. Inserte la cesta en la carcasa dedicada del procesador y cierre la tapa de la réplica.Utilice la pantalla táctil del ordenador del instrumento para definir el protocolo de trabajo seleccionando la secuencia de soluciones, la sincronización y la temperatura, que se implementarán de acuerdo con el esquema proporcionado en la tabla. Haga clic en el icono del ordenador dedicado para asignar el protocolo a la réplica que contiene la cesta del cassette y haga clic en el botón de inicio. Cuando el instrumento confirme el final del protocolo con un icono dedicado y un tono de alarma, abra la tapa de la réplica y retire la cesta del procesador.Una hora antes de la incrustación del tejido, encienda el embedder automatizado y espere hasta que la parafina se derrita por completo como lo indica el termómetro de baño de parafina en el instrumento. Transfiera manualmente hasta 32 casetes procesados desde la cesta del procesador al bastidor de incrustación y abra la tapa principal del incrustador. Utilice la pantalla táctil para indicar al sistema robótico que se está insertando un bastidor y abrir la tapa de la carcasa de entrada.Inserte hasta cuatro bastidores en la carcasa de entrada y cierre la tapa de la carcasa de entrada. A continuación, utilice la pantalla táctil para iniciar el procedimiento de incrustación como se indica en la tabla. Cuando el instrumento confirme el final del protocolo con el icono dedicado, retire el bastidor de salida y cierre la tapa principal del incrustador.A continuación, transfiera los bloques incrustados desde el bastidor a una caja de almacenamiento. El acortamiento del colon, y la expresión colónica de genes pro inflamatorios, son parámetros ampliamente utilizados para puntuar la presencia de sulfato de sodio dextrano o inflamación inducida por DSS. La infiltración de células inflamatorias en la lámina intestinal propria también se mejora en gran medida por el tratamiento DSS.La tinción de H&E de muestras no tratadas procesadas por automatización como se ha demostrado, revela menos células inflamatorias infiltrantes, alteraciones epiteliales y cambios en la arquitectura de la mucosa en comparación con las muestras de animales tratados con DSS. La calidad de la preparación y la incrustación del tejido murino realizada por los instrumentos automatizados puede ser confirmada adicionalmente por tinción inmunohistoquímica para CD20 y Mallory Trichrome Staining. En particular, el procesamiento automatizado de muestras permite consistentemente la evaluación de una mayor proporción de parámetros histológicos, que las muestras procesadas por el método manual.Tenga cuidado de insertar correctamente el tejido en la rejilla para esperar a que el procesador automatizado esté listo, y esperar a que la parafina se derrita por completo. Este método se puede utilizar para realizar análisis histológicos de cualquier tejido murino, con el qualitive de muestras histológicas humanas que se utilizarán en modelos murinos de patólogos humanos. Esta técnica ya ha sido un estudio exitoso para el estudio de la inflamación del tejido inflamatorio, y será útil para el estudio de modelos de cáncer murino colorrectal.Como algunos reactivos utilizados en este protocolo son peligrosos, recuerde usar siempre guantes de protección, gafas y una capa de laboratorio al realizar este procedimiento.

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