Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

نحن ممتنون للسيد كلاوس الحافلة والسيدة ريتا Rosendahl في إينانو الخاصة بالمساعدة التقنية. شكر خاص إلى الدكتور دانييل أوتزين للسماح لنا الاستخدام المتكرر لبلده أولتراسينتريفوجي. وأيد هذه الدراسة أن الدانمرك "صندوق الابتكار" (حشد المشروع).

ملاحظة: متوسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (ماجستير وسائل الإعلام) أعد مسبقاً كما هو مبين في الجدول للمواد.
1-خلية ثقافة
ملاحظة: يمكن الحصول على الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة من نخاع العظام، والأنسجة الدهنية أو مصادر أخرى11. وبدلاً من ذلك...

<ol>
	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update.">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances,+challenges,+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology:+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop.">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li><li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018)</li><li>. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1&#8211;48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018)</li><li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles.">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li><li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+-+current+trends+and+future+prospective.">Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective.</a> Bioscience Reports. 35 (2), (2015).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Methods+of+Choice+for+Extracellular+Vesicles+(EVs)+Characterization.">The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data.">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li><li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomal-miRNAs+are+critical+factors+for+inducing+anti-proliferation+signalling+to+A2780+and+SKOV-3+ovarian+cancer+cells.">Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 38498 (2016).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Asghar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomonas+sp+is+a+Novel+Cell+Culture+Contaminant.">Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).</li></ol>

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتسلسل الجيل القادم من اكسرناس التي تمكن من تحليل التعبير التفاضلية من العينات المدخلات المنخفضة. الانضمام إلى بروتوكول معين لعزل EV واكسرنا مهم لأن التعديلات حتى الصغيرة (أي خطوة تنبيذ فائق أو تغيير نوع الدوار) يمكن أن تؤثر الترنسكربيتوم وميرنا المستويات<sup class="xre...

خارج الخلية وتعميم الكشف (اكسرناس) موجودة في سوائل الجسم المختلفة وهي مقاومة نحو رنسيس1،2. وفرة عالية، واستقرارها وسهولة الوصول بشكل جذاب للتقييم السريري كعلامات التشخيص وتنبؤاتها3. واسطة النقل اكسرناس وتشمل حويصلات خارج الخلية (EVs)، رابطة مع البروتينات الدهنية (مثل البروتين الدهني الكثافة؛ الحميد) ومجمعات ريبونوكليوبروتين (مثل مع مجمعات Argonaute2)4.
هي مجموعة فرعية اكسرناس ميكرورناس (ميرناس)، وصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 22 nt التي تنظم التعبير الجيني بوسترانسكريبشونال. ميرناس السابقين قد تورطت في خلية خلية الاتصال وتنظيم التوازن الخلية5. على سبيل المثال، يسلم الحميد السابقين-مير-223 إلى خلايا بطانية لقمع جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) والتهاب6. من المثير للاهتمام، كما يعتبر المنقولة من حويصلات خارج الخلية من الكريات البيضاء إلى خلايا سرطان الرئة، برمجة إليها اتخاذ على النمط الظاهري أكثر الغازية7مير-223. وهكذا، الترنسكربيتوم ميرناس السابقين من مختلف سوائل الجسم وخلية الثقافة المتوسطة سوف تحسن كثيرا من فهمنا لإشارات السابقين-ميرنا.
الجيش الملكي النيبالي الصغيرة تسلسل (seq رنا الصغيرة) هو أداة قوية يمكن استخدامها لفهم ترانسكريبتوميكس الكشف الصغيرة. ويمكن مقارنة عينات مختلفة بين الكشف عن خلطات المعروفة، بل يمكن أيضا الكشف عن رواية الكشف الصغيرة وتتميز. ونتيجة لذلك، كما أنها وسيلة قوية لتحديد ميرناس أعرب عن خلطات تحت ظروف مختلفة. واحدة من عقبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة غير أن الصعوبة في توليد مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل اكسرنا منخفضة المدخلات مثل السوائل المخية، اللعاب، البول، والحليب، والمصل ووسائل الإعلام الثقافة. يتطلب البروتوكول "تراسك الصغيرة رنا المكتبة الإعدادية" من إيلومينا تقريبا 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي إجمالي جودة عالية ويتطلب البروتوكول "نيبنيكست الصغيرة رنا المكتبة الإعدادية مجموعة" من نيو إنجلاند Biolabs 100 ميكروغرام 1 نانوغرام من الجيش النيبالي الملكي8،9. وفي أحيان كثيرة، مجموع الجيش الملكي النيبالي من هذه العينات الكشف عن الحد الأدنى للتقليدية تجاه الأشعة فوق البنفسجية الطيفية.
السابقين-ميرناس المستمدة من سوائل الجسم علامات تشخيصية والتشخيص يحتمل أن تكون جيدة. بيد من أجل دراسة الآثار الفنية أو لتحديد منشأ محددة السابقين-ميرناس، خلية ثقافة النظم غالباً ما تستخدم بدلاً من ذلك. وقد درست الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على نطاق واسع لأن تلك المركبات قد تورطت في التخفيف من كثير من الأمراض بما في ذلك احتشاء عضلة القلب ومرض الزهايمر والابتزاز مقابل المرض المضيف10. هنا، نحن إظهار تنقية ميرناس السابقين من MSCs المشتقة من نخاع العظام (بمسكس) والخطوات المحددة المستخدمة لتحسين البناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل وتحليل البيانات (الشكل 1).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

الكشف خارج الخلية وتعميم (اكسرنا) يتم إنتاجها بواسطة العديد من أنواع الخلايا في الجسم وتوجد في العديد من سوائل الجسم مثل اللعاب والبلازما والمصل، والحليب والبول. هي واحدة من مجموعة فرعية من هذه الكشف المنظمين بوسترانسكريبشونال – ميكرورناس (ميرناس). لتحديد ميرناس تنتجها أنواع محددة من الخلايا، يمكن استخدام نظم الاستزراع في المختبر للحصاد، واكسرناس الشخصية المستمدة من مجموعة فرعية واحدة من الخلايا. العوامل يفرز من الخلايا الجذعية الوسيطة متورطون في التخفيف من العديد من الأمراض، ويستخدم كالنظام النموذجي في المختبر هنا. وتصف هذه الورقة عملية جمع، وتنقية من الحمض النووي الريبي الصغيرة وتوليد المكتبة إلى تسلسل ميرناس خارج الخلية. اكسرناس من وسائط الثقافة تختلف عن الحمض النووي الريبي الخلوية كونها منخفضة عينات من الحمض النووي الريبي الإدخال، الذي يدعو إلى إجراءات محسنة. يوفر هذا البروتوكول دليل شامل للتسلسل اكسرنا صغيرة من وسائط الثقافة، تظهر نقاط التفتيش لمراقبة الجودة في كل خطوة أثناء تنقية اكسرنا وتسلسلها.

الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول هو الأمثل لجمع اكسرنا من الثقافة لجنة السلامة البحرية لتسلسل الجيل القادم. الخطة الشاملة لسير العمل في الشكل رقم 1 على اليسار ونقاط التفتيش كل منها مراقبة الجودة على الحق.
مورفولوجيا ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

هذا البروتوكول يوضح كيفية تنقية microRNAs خارج الخلية من خلية ثقافة وسائل الإعلام لبناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل الجيل القادم. مختلف نقاط التفتيش لمراقبة الجودة ويرد وصف للسماح للقراء لفهم ما يمكن توقعه عند العمل مع نماذج الإدخال المنخفضة مثل اكسرناس.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

هذه هي الورقة الأولى التي تعالج المشاكل التقنية في تسلسل الحمض النووي الرنا الصغيرة المستمدة من الخلايا خارج الخلية من الخلايا. تتطلب عينات NGS إعدادًا صارمًا ومراقبة الجودة. ونظرا لطبيعة المركبات الكهربائية، فإن عملية مراقبة الجودة لعينات EV تنحرف عن القاعدة.وميزة هذا البروتوكول هي خطوات مراقبة الجودة في ذلك للمستخدمين لأول مرة. إثبات الإجراء سيكون (جويني سو) مساعد باحث من مختبري للبدء، لوحة الخلايا الجذعية mesenchymal الإنسان في 2،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسائل الإعلام MSC الطازجة في خمس قارورة T175.ثم تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5 ٪ واستبدال وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام، حتى يتم الحصول على خمس قارورة من 90٪ من الخلايا التقاء. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات مع 20 ملليلتر من PBS لكل قارورة. إضافة 20 ملليلتر من وسائل الإعلام مجموعة EV في كل قارورة.واحتضان لهم في 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. جمع وسائل الإعلام والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 غرام و أربع درجات مئوية. ثم جمع المابير، وأجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام لمدة 20 دقيقة في 2،000 غرام و أربع درجات مئوية.جمع الماسخ مرة أخرى، وأجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام لمدة 30 دقيقة في 15، 500 غرام و أربع درجات مئوية. جمع ناظر للمرة الأخيرة. بعد ذلك، نقل وسائل الإعلام إلى أنابيب فائقة التركيز.ويستخدم 60Ti زاوية ثابتة الدوار هنا، وسوف تكون راسية بيليه إلى جانب الأنبوب. وضع علامة على جانب الغطاء حيث من المتوقع بيليه، ورسم دائرة على جانب الأنبوب حيث من المتوقع بيليه. و بيليه exRNAs لمدة 90 دقيقة في 100، 000 غرام وأربع درجات مئوية.بعد الطرد المركزي النهائي، إزالة ناطور. استخدم قطع صغيرة من الورق الماص لتجفيف داخل الأنبوب دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب. ثم عكس الأنبوب على ورقة ماصة.لإعادة بناء بيليه، إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في كل أنبوب، ودوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية. الماصات صعودا وهبوطا 20 مرة. ثم تقييم الخلايا خارج الخلية والجزيئات الحيوية الأخرى مع تحليل تتبع الجسيمات النانوية.وتخزين بيليه في ناقص-80 درجة مئوية حتى مزيد من التجارب. بعد ذوبان العينات، استخدم طقم عزل RNA لاستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. Elute الجيش الملكي النيبالي من العمود المقدمة في طقم العزل RNA في 100 ميكرولترات من المياه RNAse خالية.لتركيز الحمض النووي الريبي من خلال هطول الأمطار الإيثانول، إضافة ميكرولتر واحد من الجليكوجين، 10 ميكرولترات من اثنين من حمض نووي مولار-5.5 خلات الصوديوم، و 250 ميكرولترات من قبل المبردة 99٪ الإيثانول في 100 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المنقى. ثم احتضان العينات في ناقص 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتسريع الجيش الملكي النيبالي. ل بيليه الجيش الملكي النيبالي، الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 16، 000 غرام وأربع درجات مئوية.بعد ذلك، إزالة ناظر، وغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع ملليلتر واحد من 75٪ الإيثانول. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق في 16،000 ز و 4 درجات مئوية إلى بيليه الجيش الملكي النيبالي. إزالة الإيثانول، وترك غطاء أنبوب RNA مفتوحة لمدة خمس إلى 10 دقائق لتجفيف الهواء بيليه الحمض النووي الريبي.Resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في سبعة ميكرولترات من المياه RNAse خالية، واستخدام آلة الكهرباء الشعرية القائمة على رقاقة للكشف عن جودة الحمض النووي الريبي والتركيز. لبدء بناء المكتبة، ماصة خمسة ميكروليترس من الجيش الملكي النيبالي في أنبوب PCR قبل المبردة 0.2 ملليلتر. بعد ذلك، تمييع محولات 3'في المياه RNAse خالية بنسبة حجم واحد إلى 10.إضافة 0.5 ميكرولترات من محول المخفف في أنبوب RNA، والماصات الخليط صعودا وهبوطا ثماني مرات. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع كل السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان خليط محول الحمض النووي الريبي في 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين في دورة حرارية مسخنة مسبقا.ثم ضع العينة مرة أخرى على الكتلة المبردة. بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من العازلة الربط، 0.5 ميكرولترات من مثبطات RNAse، و 0.5 ميكرولترات من T4 الحمض النووي الريبي في خليط محول الحمض النووي الريبي. الماصات صعودا وهبوطا ثماني مرات، والطرد المركزي لفترة وجيزة.ثم احتضان الأنبوب في 28 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الدورة الحرارية المسخّن مسبقا. بعد ذلك، إضافة 0.5 ميكرولترات من محلول التوقف في أنبوب العينة، مع أنبوب البقاء في دورة الحرارية. الماصات صعودا وهبوطا ثماني مرات، والاستمرار في احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.تخفيف 5'محولات في المياه RNAse خالية بنسبة حجم واحد إلى 10. أضف 0.5 ميكرولترات من المحول المخفف إلى أنبوب PCR منفصل 0.2 ملليلتر. سخني المحول 5'في 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين.ثم ضع العينة على الكتلة المبردة. إضافة 0.5 ميكرولترات من 10 نانومول ATP و 0.5 ميكرولترات من T4 RNA ligase إلى أنبوب 5'محول. الماصات صعودا وهبوطا ثماني مرات.وطرد مركزي لفترة وجيزة لجمع كل السوائل في القاع. بعد ذلك، إضافة 1.5 ميكرولترات من خليط 5'محول في عينة RNA. الماصات ثماني مرات بلطف شديد، واحتضان العينة في 28 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.للحصول على cDNA، تمييع التمهيدي النسخ العكسي في المياه الخالية من RNAse بنسبة حجم واحد إلى 10. إضافة 0.5 ميكرولترات من التمهيدي المخفف في عينة الحمض النووي الريبي، ماصة ثماني مرات بلطف شديد، والطرد المركزي لفترة وجيزة. ثم احتضان الحمض النووي الريبي وخليط التمهيدي في 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين في دورة الحرارية المسخّن مسبقا.ثم ضع العينة على كتلة مبردة. المقبل, إضافة ميكرولتر واحد من 5X أول ستراند العازلة, 0.5 ميكرولترات من 12.5 ملليمتر DNTP خليط, 0.5 ميكرولترات من 100 ملليمولار DTT, 0.5 ميكرولترات من مثبطات RNAse, و 0.5 ميكرولترات من النسخ العكسي في أنبوب عينة. الماصات ثماني مرات بلطف شديد.وطرد مركزي لفترة وجيزة. احتضان العينة في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في دورة الحرارية المسخّن مسبقا. بعد ذلك، إضافة 4.25 ميكرولترات من المياه فائقة الpure، 12.5 ميكرولترات من مزيج PCR، واحد ميكرولتر من التمهيدي مؤشر، وميكر واحد من التمهيدي العالمي في عينة cDNA.الماصات صعودا وهبوطا ثماني مرات، والطرد المركزي لفترة وجيزة. وأخيراً، ضع العينة في دورة حرارية، و إعداد الدراجات وفقاً للمخطوطة. لتنقية مكتبة RNA، استخدم جزء حجم الحمض النووي الآلي لتكهين الأشرطة بين 140 و160 زوجًا أساسيًا.تشغيل المكتبة المستخرجة على عمود القائمة على مجموعة تنقية PCR، وeute المكتبة في 10 ميكرولترات من المياه RNAse خالية. للتحقق من حجم المكتبة، قم بتحميل ميكرولتر واحد من المكتبة المنقاة على رقاقة الحمض النووي، واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. لتحديد تركيز المكتبة، أولاً تخفيف ميكرولتر واحد من المكتبة المنقية في 10 ملليمولار pH-8.0 تريس-Hcl مع 0.05٪ بوليسوربات 20 بمعدل حجم واحد إلى 1، 000.ثم قم بتشغيل QPCR باستخدام معايير الحمض النووي طقم القياس الكمي للمكتبة التجارية. وأخيراً، تجمع كميات متساوية من المكتبات وفقا لمتطلبات آلة التسلسل، وتسلسل على نظام تسلسل عالية الإنتاجية. وشمل المخطط الكهربائي للرنا خارج الخلية مجموعة واسعة من الحمض النووي الريبي الريبي.وعلى النقيض من ذلك، أظهر الحمض النووي الخلوي قمم متميزة جدا، المقابلة ل5STRNA، 5.8SRRNA، 18SRRNA، و 28SRRNA. وكانت الجودة الناتجة عن ذلك للمكتبتين عالية وقابلة للمقارنة. وأظهر توزيع طول المكتبتين ذروة واحدة عند 22 نوكليوتيدات، مع ارتباطها بالمغذيات الريبة.وعلى النقيض من ذلك، كانت المكتبات من الرنا الرنا خارج الخلية أكثر تجانساً، واحتوت على قمتين أكثر ترتبطان بالذرات الـ RNAs، أو النصفين والشظايا، أو الـ piRNAs. تم تعيين 65٪ من القراءات من الحمض النووي الريبي الخلوي إلى microRNAs البشرية ، وكل من الحمض النووي الريبي الصغير الآخر يمثل جزءًا صغيرًا من القراءات المعينة. وعلى النقيض من ذلك، فإن 8٪ فقط من الرنا الرنا خارج الخلية تتطابق مع الرنا الصغير البشري.وكان الجيش الملكي النيبالي الصغيرة الأكثر وفرة التي كانت قراءات تعيين tRNAs، ويطابقها في وقت لاحق لا مثيل لها لتسلسلات بكتيرية. وتشير مقارنة مع جينوم الأبقار إلى أن FBS لم تكن مصدرا للتلوث. وبالتالي، RNAs خارج الخلية يحمل لمحة غير نمطية بالمقارنة مع الحمض النووي الريبي الخلوي العادي.وتعد المكتبة جزءاً حاسماً من هذا البروتوكول. يجب أن يتم خلط بلطف شديد لتجنب فقاعات من تشكيل. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للتحقيق في ملف تعريف exRNAs من أنواع أخرى من الخلايا، مما يساعد على دراسة وظيفة exRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

خط أنابيب كامل لعزل وتسلسل MicroRNAs، وتحليلها باستخدام أدوات المصادر المفتوحة

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...