Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Mr. Claus Bus og Ms. Rita Rosendahl ved iNANO for deres tekniske bistand. En særlig tak til Dr. Daniel Otzen for at tillade vores hyppige brug af hans ultracentrifuge. Denne undersøgelse blev støttet af Danmarks innovationsfond (MUSTER projekt).

Bemærk: Vækstmediet mesenchymale stamceller (MSC medier) er udarbejdet på forhånd som angivet i Tabel af materialer.
1. cellekultur
Bemærk: Humane mesenkymale stamceller kan fås fra knoglemarven, fedtvæv eller andre kilder11. Alternativt kan hMSCs købes gennem en leverandør. BMSCs anvendes i denne protokol blev afledt fra knoglemarven af patienter og købt fra et firma.
<ol><li>Tø 1 x 106 BMSCs i en T17...

<ol>
	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update.">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances,+challenges,+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology:+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop.">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li><li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018)</li><li>. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1&#8211;48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018)</li><li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles.">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li><li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+-+current+trends+and+future+prospective.">Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective.</a> Bioscience Reports. 35 (2), (2015).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Methods+of+Choice+for+Extracellular+Vesicles+(EVs)+Characterization.">The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data.">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li><li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomal-miRNAs+are+critical+factors+for+inducing+anti-proliferation+signalling+to+A2780+and+SKOV-3+ovarian+cancer+cells.">Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 38498 (2016).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Asghar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomonas+sp+is+a+Novel+Cell+Culture+Contaminant.">Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).</li></ol>

Her, beskriver vi en protokol for næste generation sequencing af exRNAs, der muliggør differentieret udtryk analyser fra lav input prøver. Tilslutte sig en bestemt protokol for EV og exRNA isolation er vigtig, fordi selv små ændringer (dvs. ultracentrifugering trin eller en ændring i rotoren type) kan påvirke transkriptom og miRNA niveauer13,14. Derfor, uanset hvordan exRNA er isoleret, er det vigtigt at anvende samme eksperimentelle og bioinformatic proce...

Ekstracellulære og cirkulerende RNA'er (exRNAs) er til stede i forskellige kropsvæsker og er resistente mod RNases1,2. Deres høje overflod, stabilitet og brugervenlighed tilgængelighed er attraktive for klinisk vurdering som diagnostiske og prognostiske markører3. Transportform for exRNAs omfatter ekstracellulære vesikler (EVs), association med lipoprotein (såsom high-density lipoprotein; HDL) og ribonucleoprotein komplekser (såsom med Argonaute2 komplekser)4.
Et undersæt af exRNAs er MicroRNA (miRNAs), som er små, ikke-kodende RNA'er af omkring 22 nt, der regulerer posttranskriptionelle genekspression. Ex-miRNAs har været impliceret i celle-celle kommunikation og regulering af celle homøostase5. For eksempel, HDL leverer ex-miR-223 i endothelial celler til at undertrykke intercellulære vedhæftning molekyle 1 (ICAM-1) og betændelse6. Interessant, ses miR-223 også transporteres af ekstracellulære vesikler fra leukocytter til lunge kræftceller, programmering dem til at påtage sig en mere invasive fænotype7. Således vil transkriptom af ex-miRNAs fra forskellige kropsvæsker og cellekulturmedium forbedre vores forståelse af ex-miRNA signalering.
Små RNA sekventering (små RNA FF.) er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at forstå transcriptomics af små RNA'er. Ikke kun kan sammenlignes med forskellige stikprøver blandt varierende udtrykt kendte RNA'er, men romanen små RNA'er kan også registreres og karakteriseret. Derfor er det også en robust metode til at identificere varierende udtrykt miRNAs under forskellige betingelser. En af forhindringerne for små RNA seq er imidlertid vanskeligheder med at skabe små RNA seq biblioteker fra lav exRNA input væsker som cerebrospinal væsker, spyt, urin, mælk, serum og kultur medier. TruSeq små RNA bibliotek Prep protokollen fra Illumina kræver ca 1 µg af høj kvalitet total RNA og NEBNext små RNA bibliotek Prep indstille protokollen fra New England Biolabs kræver 100 ng-1 µg RNA8,9. Oftentimes, total RNA fra disse prøver er under detektionsgrænsen for konventionelle UV-vis spektrofotometre.
Ex-miRNAs afledt af kropsvæsker er potentielt god diagnostiske og prognostiske markører. Men for at studere de funktionelle virkninger eller for at bestemme oprindelsen af specifikke ex-miRNAs celle kultur systemer ofte bruges i stedet. Mesenchymale stamceller (msc) har været studeret grundigt, fordi deres evt har været impliceret i lindre mange sygdomme, herunder myokardieinfarkt, Alzheimers sygdom og graft versus host sygdommen10. Her, vise vi rensning af ex-miRNAs fra knoglemarv-afledte MSCs (BMSCs) og de specifikke trin bruges til at optimere små RNA bibliotek byggeri, sekventering og dataanalyse (figur 1).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

Ekstracellulære og cirkulerende RNA'er (exRNA) er produceret af mange celletyper i kroppen og findes i talrige kropsvæsker såsom spyt, plasma, serum, mælk og urin. Et undersæt af disse RNA'er er posttranskriptionelle lovgiverne – MicroRNA (miRNAs). For at afgrænse miRNAs produceret af specifikke celletyper, in vitro-kultur systemer kan bruges til at høste og profil exRNAs stammer fra en delmængde af celler. De udskilles faktorer af mesenkymale stamceller er impliceret i lindre mange sygdomme og bruges som in vitro-modelsystemet her. Dette papir beskriver processen for indsamling, rensning af små RNA og bibliotek generation at sekvens ekstracellulære miRNAs. ExRNAs fra kultur medier afviger fra cellulære RNA ved at være lavt RNA input prøver, som opfordrer til optimeret procedurer. Denne protokol giver en omfattende guide til små exRNA sekventering fra dyrkningsmedier, viser kvalitetskontrol checkpoints på hvert trin under exRNA rensning og sekventering.

De i denne protokol beskrevne metode er optimeret til at indsamle exRNA fra MSC kultur for næste generation sequencing. Den samlede ordning af arbejdsprocessen er i figur 1 til venstre og de respektive kvalitetskontrol checkpoints er til højre.
Morfologi af celler på indsamlingsdagen for udifferentierede (figur 3A) og differentieret (figur 3B</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, sekventering og analysere ekstracellulære MicroRNA fra humane mesenkymale stamceller

Denne protokol demonstrerer, hvordan til at rense ekstracellulære MicroRNA fra celle kultur medier for små RNA bibliotek opbygning og næste generation sequencing. Forskellige kvalitetskontrol checkpoints er beskrevet til at give læserne til at forstå, hvad de kan forvente når du arbejder med lav input prøver som exRNAs.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Dette er det første papir, der omhandler tekniske problemer i sekventering små RNAs stammer fra ekstracellulære vesikler fra celler. NGS-prøver kræver streng forberedelse og kvalitetskontrol. På grund af arten af elbiler, QC processen med EV prøver afviger fra normen.Fordelen ved denne protokol er QC trin deri for første gang brugere. Demonstration af proceduren vil være Junyi Su, en forskningsassistent fra mit laboratorium. Til at begynde, plade menneskelige mesenkymale stamceller på 2, 000 celler per kvadratcentimeter i friske MSC medier i fem T175 kolber.Derefter vokse cellerne ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid miljø og erstatte medierne hver to til tre dage, indtil fem kolber af 90% sammenløb celler opnås. Dernæst vaskes cellerne tre gange med 20 milliliter PBS pr. kolbe. Der tilsættes 20 milliliter EV-samlingsmedier i hver kolbe.Og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid miljø i 48 timer. Saml medierne og centrifuge det i 10 minutter ved 300 g og fire grader Celsius. Derefter indsamle supernatant, og centrifuge medierne i 20 minutter ved 2, 000 g og fire grader Celsius.Saml supernatanten igen, og centrifuge medierne i 30 minutter ved 15, 500 g og fire grader Celsius. Saml supernatanten for sidste gang. Dernæst overføre medierne til ultracentrifuge rør.En 60Ti fast vinkel rotor bruges her, og pellet vil blive forankret til siden af røret. Marker den side af låget, hvor pellet forventes, og tegn en cirkel på siden af røret, hvor pellet forventes. Og pellet exRNA'erne i 90 minutter ved 100, 000 g og fire grader Celsius.Efter den endelige centrifugering fjernes supernatanten. Brug små stykker absorberende papir til at tørre indersiden af røret uden at røre bunden af røret. Og derefter vende røret på en absorberende papir.For at resuspendre pellet, tilsæt 200 mikroliter af PBS i hvert rør, og vortex røret i 30 sekunder. Pipette op og ned 20 gange. Vurder derefter de ekstracellulære vesikler og andre biomolekyler med nanopartikelsporingsanalyse.Og opbevar pellet på minus-80 grader Celsius indtil yderligere eksperimenter. Efter optøning af prøverne skal du bruge et RNA-isolationssæt til at udtrække RNA i henhold til producentens protokol. Eluter RNA fra kolonnen i RNA isolationssættet i 100 mikroliter RNAse-frit vand.For at koncentrere RNA'et gennem ethanolfældning tilsættes en mikroliter glykogen, 10 mikroliter af to-molar pH-5,5 natriumacetat og 250 mikroliter af forkølet 99% ethanol i 100 mikroliter af det rensede RNA. Derefter inkubere prøverne ved minus-20 grader Celsius natten over for at udfælde RNA. At pellet RNA, centrifuge i 20 minutter ved 16, 000 g og fire grader Celsius.Dernæst skal du fjerne supernatant, og vask RNA pellet med en milliliter 75% ethanol. Centrifuge igen i fem minutter ved 16, 000 g og fire grader Celsius til pellet RNA. Fjern ethanolen, og lad låget på RNA-røret stå åbent i fem til 10 minutter for at lufttørre RNA-pellets.Opsvar RNA-pellet i syv mikroliter RNAse-frit vand, og brug en chipbaseret kapillær elektroforesemaskine til at detektere RNA-kvaliteten og koncentrationen. For at begynde bibliotekskonstruktionen pipette fem mikroliter af RNA'et i et forkølet 0,2 milliliter PCR-rør. Dernæst fortyndes 3'adaptere i RNAse-frit vand ved et en-til-10 volumenforhold.Der tilsættes 0,5 mikroliter af den fortyndede adapter i RNA-røret, og blandingen pipetteres op og ned otte gange. Centrifuge kort for at indsamle al væsken i bunden af røret. Inkuber RNA-adapterblandingen ved 70 grader Celsius i to minutter i en forvarmet termiskcyktur.Og derefter placere prøven tilbage på den kølede blok. Dernæst tilsættes en mikroliter af ligationsbufferen, 0,5 mikroliter RNAse-hæmmer og 0,5 mikroliter af T4 RNA-ligaen i RNA-adapterblandingen. Pipette op og ned otte gange, og centrifuge kort.Derefter inkubere røret ved 28 grader Celsius i en time i forvarmet termiskcykelr. Dernæst tilsættes 0,5 mikroliter af stopopløsningen i prøverøret, hvor røret opholder sig i den termiske cycler. Pipette op og ned otte gange, og fortsætte med at inkubere ved 28 grader Celsius i 15 minutter.Fortynd 5'adaptere i RNAse-frit vand ved et en-til-10 volumenforhold. Der tilsættes 0,5 mikroliter af den fortyndede adapter i et separat 0,2 milliliter PCR-rør. Varm 5'adapter ved 70 grader Celsius i to minutter.Og derefter placere prøven på den kølede blok. Der tilsættes 0,5 mikroliter 10-nanomol ATP og 0,5 mikroliter af T4 RNA-ligasen til 5'adapterrøret. Pipette op og ned otte gange.Og centrifuge kort for at samle alle væskerne i bunden. Dernæst tilsættes 1,5 mikroliter af 5'adapter blandingen i RNA-prøven. Pipette otte gange meget forsigtigt, og inkubere prøven ved 28 grader Celsius i en time.For at opnå cDNA skal den omvendte transskriptionsprimer fortyndes i RNAse-frit vand ved et en-til-10 volumenforhold. Der tilsættes 0,5 mikroliter af den fortyndede primer i RNA-prøven, pipette otte gange meget forsigtigt og centrifuge kort. Derefter inkubere RNA og primer blandingen ved 70 grader Celsius i to minutter i forvarmet termiskcykelr.Og derefter placere prøven på en kølet blok. Dernæst tilsættes en mikroliter af 5X First Strand Buffer, 0,5 mikroliter af 12,5-millimolar DNTP blanding, 0,5 mikroliter af 100-millimolar DTT, 0,5 mikroliter af RNAse hæmmer, og 0,5 mikroliter af omvendt transskription i prøverøret. Pipette otte gange meget forsigtigt.Og centrifuge kort. Inkuber prøven ved 50 grader Celsius i en time i den forvarmede termiske cycler. Dernæst tilsættes 4,25 mikroliter ultrarent vand, 12,5 mikroliter af PCR-blandingen, en mikroliter af indeksprimeren og en mikroliter af den universelle primer i cDNA-prøven.Pipette op og ned otte gange, og centrifuge kort. Endelig anbringes prøven i en termisk cykelr, og opsæt cykelren i henhold til manuskriptet. For at rense RNA-biblioteket skal du bruge en automatiseret DNA-størrelsefraktionator til at elute båndene mellem 140 og 160 basispar.Kør det udtrukne bibliotek på et kolonnebaseret PCR-rensesæt, og eluter biblioteket i 10 mikroliter RNAse-frit vand. Hvis du vil kontrollere bibliotekets størrelse, skal du indlæse en mikroliter af det rensede bibliotek på en DNA-chip og følge producentens protokol. For at kvantificere bibliotekskoncentrationen skal du først fortynde en mikroliter af det rensede bibliotek i 10-millimolar pH-8,0 Tris-Hcl med 0,05% polysorbat 20 ved et en-til-1,000 volumenforhold.Kør derefter QPCR ved hjælp af DNA-standarderne i det kommercielle biblioteks kvantificeringssæt. Endelig pulje lige store mængder af bibliotekerne i henhold til kravene i sekventering maskine, og sekvens på en høj-throughput sekventering system. Elektrofærogrammet af ekstracellulære RNA'er omfattede en bred vifte af RNA.I modsætning hertil viste cellulære RNA meget forskellige toppe, svarende til 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA og 28SrRNA. Den deraf følgende kvalitet af begge biblioteker var høj og sammenlignelig. Længden fordeling af begge biblioteker viste en enkelt top på 22 nukleotider, med korrelerer med microRNAs.I modsætning hertil var bibliotekerne fra ekstracellulære RNA'er mere heterogene og indeholdt yderligere to toppe, som korrelerer med tRNA'er, halvdele og fragmenter eller piRNA'er. 65% af læser fra cellulære RNA blev kortlagt til menneskelige microRNA'er, og hver af de andre små RNA'er tegnede sig for en lille del af de kortlagte læser. Kontrasterende, kun 8% af ekstracellulære RNAs matchede til menneskelige microRNAs.Den mest rigelige lille RNA, som læser kortlagt var tRNAs, og de uovertrufne læser senere matchede til bakterielle sekvenser. En sammenligning med kvæggenomet tydede på, at FBS ikke var en kilde til kontaminering. Derfor udviser ekstracellulære RNA'er en atypisk profil sammenlignet med normalt cellulært RNA.Bibliotek forberedelse er en afgørende del af denne protokol. Blanding skal gøres meget forsigtigt for at undgå bobler fra formning. Denne metode kan også bruges til at undersøge profilen af exRNA'er fra andre typer celler, som hjælper med at undersøge funktionen af exRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Tekniske kunstige faktorer til specifikt manipulation af alternativ splejsning i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input Genome Sequencing bibliotek forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøvemateriale

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinatorisk encellede tilgang til at karakterisere de molekylære og Immunophenotypic heterogenitet af menneskelige stamceller og stamfader populationer

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering af mRNA fra fuldblod ved hjælp af Nanopmalm sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Enkelt celle-RNA-sekvensering og analyse af humane bugspytkirtel-øer

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

En komplet pipeline til isolering og sekvensering af MicroRNAs og analyse af dem ved hjælp af open source-værktøjer

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generation af definerede genomiske modifikationer med CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...