Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Wij zijn dankbaar aan Mr. Claus Bus en mevrouw Rita Rosendahl op iNANO voor hun technische bijstand. Speciale dank aan Dr. Daniel Otzen voor het toestaan van het frequente gebruik van zijn ultracentrifuge. Deze studie werd gesteund door het innovatiefonds Denemarken (MUSTER-project).

Opmerking: Mesenchymale stamcellen groeimedium (MSC media) bereid is vooraf zoals aangegeven in de Tabel van materialen.
1. de celkweek
Opmerking: Menselijke mesenchymale stamcellen kan worden verkregen uit het beenmerg, adipeus weefsel of andere bronnen11. U kunt ook kunnen hMSCs gekocht worden via een leverancier. De BMSCs gebruikt in dit protocol werden afgeleid van het beenmerg van de patiënt en gekocht van een bedrijf.</p...

<ol>
	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update.">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances,+challenges,+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology:+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop.">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li><li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018)</li><li>. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1&#8211;48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018)</li><li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles.">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li><li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+-+current+trends+and+future+prospective.">Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective.</a> Bioscience Reports. 35 (2), (2015).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Methods+of+Choice+for+Extracellular+Vesicles+(EVs)+Characterization.">The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data.">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li><li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomal-miRNAs+are+critical+factors+for+inducing+anti-proliferation+signalling+to+A2780+and+SKOV-3+ovarian+cancer+cells.">Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 38498 (2016).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Asghar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomonas+sp+is+a+Novel+Cell+Culture+Contaminant.">Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).</li></ol>

Hier beschrijven we een protocol voor de volgende generatie sequentiebepaling van exRNAs waarmee differentiële expressie analyses van lage input monsters. Vasthouden aan een specifiek protocol voor EV en exRNA isolatie is belangrijk omdat zelfs kleine veranderingen (dat wil zeggen, de ultracentrifugatie stap of een verandering in de rotor type) invloed op transcriptome uitoefenen kunnen en miRNA niveaus13,14. Dus, ongeacht hoe de exRNA geïsoleerd is, is het bel...

Extracellulaire en circuleren RNAs (exRNAs) zijn aanwezig in de verschillende lichaamsvloeistoffen en resistent zijn naar RNases1,2. Hun hoge overvloed, de stabiliteit en het gemak van toegankelijkheid zijn aantrekkelijk voor klinische beoordeling als diagnostische en prognostische markeringen3. De wijze van vervoer voor exRNAs omvatten extracellulaire blaasjes (EVs), vereniging met lipoproteïnen (zoals high-density lipoprotein; HDL) en ribonucleoprotein complexen (zoals met Argonaute2 complexen)4.
Een subset van exRNAs zijn microRNAs (miRNAs), die kleine niet-coderende RNAs van ongeveer 22 nt die regelen posttranscriptional genexpressie. Ex-miRNAs zijn betrokken bij de cel-cel communicatie en regulering van de cel homeostase5. Bijvoorbeeld, HDL ex-miR-223 levert aan endotheliale cellen te onderdrukken intercellulaire adhesie molecuul 1 (ICAM-1) en ontsteking6. MiR-223 is interessant, ook tijdens het vervoer door extracellulaire blaasjes uit leukocyten aan Long kankercellen, programmering te nemen op een meer invasieve fenotype7gezien. Transcriptome van ex-miRNAs van de verschillende lichaamsvloeistoffen en cel kweekmedium zal dus aanzienlijk verbeteren ons begrip van ex-miRNA signalering.
Kleine RNA sequencing (kleine RNA seq) is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om te begrijpen de transcriptomics van kleine RNAs. Niet alleen kunnen verschillende steekproeven onder differentially uitgedrukte bekende RNAs worden vergeleken, maar nieuwe kleine RNAs kunnen ook worden gedetecteerd en gekenmerkt. Het is bijgevolg ook een robuuste methode te identificeren differentially uitgedrukte miRNAs onder verschillende omstandigheden. Echter, een van de horden voor kleine RNA seq is de moeilijkheid bij het genereren van kleine RNA seq bibliotheken van lage exRNA input vloeistoffen zoals cerebrospinaal vocht, speeksel, urine, melk, serum en kweekmedia. Het TruSeq kleine RNA bibliotheek Prep-protocol van Illumina vereist ongeveer 1 microgram van totaal RNA van hoge kwaliteit en het instellen van NEBNext kleine RNA bibliotheek Prep protocol van New England Biolabs vereist 100 ng-1 µg van RNA8,9. Vaak, totaal RNA van deze monsters zijn onder de detectiegrens voor conventionele UV-vis spectrofotometers.
Ex-miRNAs afgeleid van lichaamssappen zijn potentieel goede prognostische en diagnostische markers. Echter, om de functionele gevolgen te bestuderen of om te bepalen van de oorsprong van bepaalde ex-miRNAs, cel cultuur systemen worden vaak gebruikt in plaats daarvan. Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn uitvoerig bestudeerd omdat hun EVs zijn betrokken bij het verlichten van vele ziekten met inbegrip van myocardinfarct, ziekte van Alzheimer en graft versus host ziekte10. Hier tonen we de zuivering van ex-miRNAs van beenmerg-afgeleide MSCs (BMSCs) en de specifieke stappen gebruikt om kleine RNA bibliotheek constructie, sequencing en data-analyse (Figuur 1) te optimaliseren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

Extracellulaire en circulerende RNAs (exRNA) worden geproduceerd door vele celtypes van het lichaam en in talrijke lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, plasma, serum, melk en urine bestaan. Een subset van deze RNAs zijn de posttranscriptional regelgevende instanties – microRNAs (miRNAs). Om de miRNAs geproduceerd door specifieke celtypes af te bakenen, in vitro cultuur systemen kunnen worden gebruikt om te oogsten en profiel exRNAs afgeleid van een subset van de cellen. De secreted factoren van mesenchymale stamcellen zijn betrokken bij het verlichten van talrijke ziekten en wordt gebruikt als het modelsysteem van in-vitro hier. Deze paper beschrijft het proces van collectie, zuivering van kleine RNA en bibliotheek generatie reeks extracellulaire miRNAs. ExRNAs van voedingsbodems verschillen van cellulaire RNA door lage input monsters van RNA, waarin wordt gepleit voor geoptimaliseerde procedures. Dit protocol biedt een uitvoerige gids voor kleine exRNA sequencing van voedingsbodems, met kwaliteitscontrole controlepunten bij elke stap tijdens de zuivering van de exRNA en de sequencing.

De in dit protocol beschreven methode is geoptimaliseerd voor het verzamelen van exRNA van MSC cultuur voor de volgende generatie sequencing. De algemene regeling van de workflow is in Figuur 1 aan de linkerkant en de respectieve kwaliteitscontrole controlepunten zijn aan de rechterkant.
De morfologie van de cellen op de dag van inzameling voor gedifferentieerdeproductie (Figuur...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Dit is het eerste papier dat technische problemen aanpakt bij het sequencing van kleine RNAs afgeleid van extracellulaire vikjes uit cellen. NGS-monsters vereisen een strenge voorbereiding en kwaliteitscontrole. Door de aard van EV's wijkt het QC-proces van EV-monsters af van de norm.Het voordeel van dit protocol is de QC stappen daarin voor nieuwe gebruikers. Het aantonen van de procedure zal Junyi Su zijn, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium. Om te beginnen, plaat menselijke mesenchymale stamcellen op 2.000 cellen per vierkante centimeter in verse MSC media in vijf T175 kolven.Dan groeien de cellen op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide milieu en vervang de media om de twee tot drie dagen, tot vijf kolven van 90% confluent cellen worden verkregen. Was vervolgens de cellen drie keer met 20 milliliter PBS per kolf. Voeg 20 milliliter EV-collectiemedia toe in elke kolf.En broed ze uit bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide milieu gedurende 48 uur. Verzamel de media en centrifuge het gedurende 10 minuten op 300 g en vier graden Celsius. Verzamel dan de supernatant, en centrifuge de media gedurende 20 minuten op 2,000 g en vier graden Celsius.Verzamel de supernatant weer, en centrifuge de media gedurende 30 minuten op 15, 500 g en vier graden Celsius. Verzamel de supernatant voor de laatste keer. Breng vervolgens de media over naar ultracentrifugebuizen.Hier wordt een 60Ti vaste hoekrotor gebruikt en de pellet wordt aan de zijkant van de buis verankerd. Markeer de zijkant van het deksel waar de pellet wordt verwacht, en teken een cirkel aan de zijkant van de buis waar de pellet wordt verwacht. En pellet de exRNAs gedurende 90 minuten op 100, 000 g en vier graden Celsius.Verwijder na de laatste centrifugatie de supernatant. Gebruik kleine stukjes absorberend papier om de binnenkant van de buis te drogen zonder de onderkant van de buis aan te raken. En dan de buis omkeren op een absorberend papier.Om de pellet opnieuw te plaatsen, voeg 200 microliter PBS in elke buis, en vortex de buis voor 30 seconden. Pipet 20 keer op en neer. Beoordeel vervolgens de extracellulaire vesicles en andere biomoleculen met nanodeeltjes tracking analyse.En bewaar de pellet op min-80 graden Celsius tot verdere experimenten. Gebruik na het ontdooien van de monsters een RNA-isolatiekit om RNA volgens het protocol van de fabrikant te extraheren. Elute het RNA uit de kolom in de RNA isolatie kit in 100 microliters van RNAse-vrij water.Om het RNA te concentreren door middel van ethanol neerslag, voeg een microliter van glycogeen, 10 microliter van twee-molaire pH-5.5 natriumacetaat, en 250 microliter van voorgekoelde 99%-ethanol in 100 microliter van het gezuiverde RNA. Vervolgens incubeer de monsters bij min-20 graden Celsius 's nachts om het RNA neer te halen. Om het RNA te pelleteren, centrifuge gedurende 20 minuten op 16, 000 g en vier graden Celsius.Verwijder vervolgens de supernatant en was de RNA-pellet met één milliliter ethanol van 75%. Centrifuge opnieuw gedurende vijf minuten op 16, 000 g en vier graden Celsius om het RNA te pelleteren. Verwijder de ethanol en laat het deksel van de RNA-buis vijf tot tien minuten open om de RNA-pellet aan de lucht te drogen.Resuspend de RNA pellet in zeven microliters van RNAse-vrij water, en gebruik een chip-gebaseerde capillaire elektroforese machine om de RNA kwaliteit en concentratie te detecteren. Om te beginnen met de bibliotheek bouw, pipet vijf microliters van het RNA in een voorgekoelde 0,2-milliliter PCR buis. Verdun vervolgens 3'adapters in RNAse-vrij water met een volumeverhouding van één tot 10.Voeg 0,5 microliter van de verdunde adapter toe aan de RNA-buis en pipet het mengsel acht keer op en neer. Centrifuge kort om alle vloeistof aan de onderkant van de buis te verzamelen. Incubeer het RNA-adaptermengsel twee minuten lang in een voorverwarmde thermische cycler bij 70 graden Celsius.En plaats het monster dan terug op het gekoelde blok. Voeg vervolgens een microliter van de ligatiebuffer, 0,5 microliter RNAse-remmer en 0,5 microliter van de T4 RNA-ligase toe aan het RNA-adaptermengsel. Pipet op en neer acht keer, en centrifuge kort.Dan incubeer de buis op 28 graden Celsius gedurende een uur in de voorverwarmde thermische cycler. Voeg vervolgens 0,5 microliter van de stopoplossing toe aan de monsterbuis, waarbij de buis in de thermische cycler blijft. Pipet op en neer acht keer, en blijven uitbroeden op 28 graden Celsius gedurende 15 minuten.Verdun 5'adapters in RNAse-vrij water met een volumeverhouding van één tot 10. Voeg 0,5 microliter van de verdunde adapter toe in een aparte PCR-buis van 0,2 milliliter. Verwarm de 5'adapter op 70 graden Celsius gedurende twee minuten.En plaats het monster dan op het gekoelde blok. Voeg 0,5 microliter ATP en 0,5 microliter van de T4 RNA-ligase toe aan de 5-adapterbuis. Pipet acht keer op en neer.En centrifuge kort om alle vloeistoffen te verzamelen in de bodem. Voeg vervolgens 1,5 microliter van het mengsel van 5'adapter toe aan het RNA-monster. Pipette acht keer heel voorzichtig, en incubeer het monster op 28 graden Celsius gedurende een uur.Om cDNA te verkrijgen, verdun de omgekeerde transcriptase primer in RNAse-vrij water met een één-op-10 volumeverhouding. Voeg 0,5 microliter van de verdunde primer toe aan het RNA-monster, pipet acht keer heel voorzichtig en centrifuge kort. Vervolgens incubeer het RNA en het primermengsel op 70 graden Celsius gedurende twee minuten in de voorverwarmde thermische cycler.En plaats het monster dan op een gekoeld blok. Voeg vervolgens een microliter 5x First Strand Buffer, 0,5 microliter van 12,5-millimolar DNTP-mengsel, 0,5 microliter van 100-millimolar DTT, 0,5 microliter RNAse-remmer en 0,5 microliter omgekeerde transcriptase in de monsterbuis toe. Pipet acht keer heel voorzichtig.En even centrifugeren. Incubeer het monster op 50 graden Celsius gedurende een uur in de voorverwarmde thermische cycler. Voeg vervolgens 4,25 microliter ultrazuiver water, 12,5 microliter van de PCR-mix, een microliter van de indexprimer en een microliter van de universele primer toe aan het cDNA-monster.Pipet op en neer acht keer, en centrifuge kort. Ten slotte, plaats het monster in een thermische cycler, en het opzetten van de cycler volgens het manuscript. Om de RNA-bibliotheek te zuiveren, gebruikt u een geautomatiseerde DNA-groottefraseator om de banden tussen 140 en 160 basisparen te ontlasten.Voer de uitgepakte bibliotheek uit op een pcr-zuiveringskit op basis van kolommen en maak de bibliotheek in 10 microliter RNAse-vrij water. Om de grootte van de bibliotheek te controleren, laadt u een microliter van de gezuiverde bibliotheek op een DNA-chip en volgt u het protocol van de fabrikant. Om de bibliotheekconcentratie te kwantificeren, verdun je eerst één microliter van de gezuiverde bibliotheek in 10-millimolar pH-8.0 Tris-Hcl met 0,05%polysorbate 20 bij een volumeverhouding van één tot 1, 000.Voer vervolgens QPCR uit met behulp van de DNA-normen van de commerciële bibliotheekkwantificeringskit. Tot slot, bundel gelijke hoeveelheden van de bibliotheken volgens de vereisten van de sequencing machine, en volgorde op een high-throughput sequencing systeem. Het elektropherogram van extracellulaire RNAs omvatte een breed scala aan RNA.Cellulair RNA vertoonde daarentegen zeer duidelijke pieken, wat overeenkomt met 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA en 28SrRNA. De resulterende kwaliteit van beide bibliotheken was hoog en vergelijkbaar. De lengteverdeling van beide bibliotheken vertoonde een enkele piek bij 22 nucleotiden, met correleert met microRNAs.De bibliotheken van extracellulaire RNAs waren daarentegen heterogeener en bevatten nog twee pieken die correleren met tRNA's, helften en fragmenten, of piRNAs. 65% van de reads van cellulair RNA werden in kaart gebracht aan menselijke microRNAs, en elk van de andere kleine RNAs goed voor een klein deel van de in kaart gebrachte leest. In tegenstelling tot contrasterend, slechts 8% van extracellulaire RNAs afgestemd op menselijke microRNAs.De meest voorkomende kleine RNA waarop de leest in kaart gebracht waren tRNAs, en de ongeëvenaarde leest later afgestemd op bacteriële sequenties. Uit een vergelijking met het rundergenoom bleek dat FBS geen bron van besmetting was. Vandaar, extracellulaire RNAs vertonen een atypisch profiel in vergelijking met normale cellulaire RNA.Bibliotheekvoorbereiding is een cruciaal onderdeel van dit protocol. Mengen moet heel voorzichtig worden gedaan om te voorkomen dat bellen vormen. Deze methode kan ook worden gebruikt om het profiel van exRNAs uit andere soorten cellen te onderzoeken, wat helpt om de functie van exRNAs te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...