Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Siamo grati al signor Claus Bus e Sig. ra Rita Rosendahl a iNANO per loro assistenza tecnica. Si ringrazia Dr. Daniel Otzen per permettere che il nostro uso frequente della sua ultracentrifuga. Questo studio è stato sostenuto dal fondo per l'innovazione Danimarca (progetto MUSTER).

Nota: Terreno di coltura delle cellule staminali mesenchimali (media MSC) è preparato in anticipo, come indicato nella Tabella materiali.
1. coltura cellulare
Nota: Le cellule staminali mesenchimali umane possono essere ottenute da midollo osseo, tessuto adiposo o altre fonti11. In alternativa, hMSCs possono essere acquistati tramite un fornitore. BMSCs utilizzata nel presente protocollo sono state derivate dal midollo osseo d...

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	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update.">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances,+challenges,+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology:+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop.">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li><li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018)</li><li>. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1&#8211;48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018)</li><li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles.">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li><li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. 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A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data.">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li><li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. 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Qui, descriviamo un protocollo per il sequenziamento di nuova generazione di exRNAs che consente l'analisi di espressione differenziale da campioni di ingresso Bassi. Aderendo a un protocollo specifico per l'isolamento di EV ed exRNA è importante perché anche piccole alterazioni (cioè, il passo di ultracentrifugazione o un cambiamento nel tipo di rotore) possono influenzare il trascrittoma e miRNA livelli13,14. Così, indipendentemente da come il exRNA è isol...

Extracellulari e circolanti RNAs (exRNAs) sono presenti in vari liquidi corporei e sono resistenti verso RNasi1,2. Loro elevata abbondanza, la stabilità e la facilità di accessibilità sono attraenti per la valutazione clinica come marcatori diagnostici e prognostici3. La modalità di trasporto per exRNAs includere vescicole extracellulari (EVs), associazione con le lipoproteine (ad esempio di lipoproteina ad alta densità; HDL) e della ribonucleoproteina complessi (come con i complessi Argonaute2)4.
Un sottoinsieme di exRNAs sono i microRNA (Mirna), che sono piccoli RNA non codificanti di circa 22 nt che regolano l'espressione genica post-trascrizionale. Ex-miRNA sono stati implicati nella comunicazione cellula-cellula e regolazione di cella omeostasi5. Per esempio, HDL spedisce ex-miR-223 alle cellule endoteliali per reprimere la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) e infiammazione6. È interessante notare che, miR-223 è visto anche trasportati dalle vescicole extracellulari dai leucociti alle cellule tumorali del polmone, programmazione ad assumere un fenotipo più invasiva7. Così, il trascrittoma di ex-Mirna da vari fluidi corporei e terreno di coltura cellulare migliorerà notevolmente la nostra comprensione della segnalazione ex-miRNA.
Piccolo RNA (piccolo RNA seq) di sequenziamento è un potente strumento che può essere utilizzato per comprendere la trascrittomica di piccoli RNA. Non solo diversi campioni possono essere confrontati tra RNAs conosciuto differenzialmente espressi, ma romanzo piccoli RNA possa anche essere rilevati e caratterizzato. Di conseguenza, è anche un metodo affidabile per identificare Mirna differenzialmente espressi in condizioni diverse. Tuttavia, uno degli ostacoli di piccoli RNA seq è la difficoltà nel generare piccole biblioteche di seq RNA da exRNA basso input fluidi come liquidi cerebrospinali, saliva, urina, latte, siero e terreni di coltura. Il protocollo di TruSeq piccolo RNA biblioteca Prep da Illumina richiede circa 1 µ g di RNA totale di alta qualità e il protocollo di NEBNext piccolo RNA biblioteca Prep Set da New England Biolabs richiede 100 ng-1 µ g di RNA8,9. Spesso, RNA totale da questi campioni sono sotto il limite di rilevamento per spettrofotometri UV-vis convenzionali.
Ex-miRNAs derivati da fluidi corporei sono potenzialmente buoni marcatori diagnostici e prognostici. Tuttavia, al fine di studiare gli effetti funzionali o per determinare l'origine del ex-miRNA specifici, sistemi di coltura cellulare, vengono spesso utilizzati. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono state studiate estesamente perché loro EVs sono stati implicati nell'alleviare molte malattie tra cui l'infarto miocardico, malattia di Alzheimer e dell'innesto contro la malattia ospite10. Qui, dimostriamo la purificazione di ex-Mirna da MSCs derivate da midollo osseo (BMSC) e i passaggi specifici utilizzati per ottimizzare la costruzione della libreria piccola RNA, sequenziamento e analisi dei dati (Figura 1).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

Extracellulare e circolanti RNAs (exRNA) sono prodotti da molti tipi di cellule del corpo ed esiste in numerosi liquidi corporei come saliva, plasma, siero, latte e urine. Un sottoinsieme di questi RNA sono i regolatori di posttranscriptional – i microRNA (Mirna). Per delineare i miRNA provocati da tipi cellulari specifici, sistemi di coltura in vitro possono essere utilizzati per la raccolta e il profilo exRNAs derivato da un sottoinsieme delle cellule. I fattori secreti di cellule staminali mesenchimali sono implicati nell'alleviazione numerose malattie e viene utilizzato come sistema modello in vitro qui. Questo articolo descrive il processo di raccolta, purificazione di piccolo RNA e generazione della libreria di sequenza extracellulare Mirna. ExRNAs da cultura media differiscono da RNA cellulare essendo Bassi campioni di RNA inpui, che chiama per procedure ottimizzate. Questo protocollo fornisce una guida completa al sequenziamento di piccolo exRNA da terreni di coltura, mostrando i punti di controllo di controllo di qualità ad ogni passo durante il sequenziamento e la purificazione di exRNA.

Il metodo descritto in questo protocollo è ottimizzato per raccogliere exRNA da cultura MSC per il sequenziamento di nuova generazione. Lo schema generale del flusso di lavoro è nella Figura 1 a sinistra e i checkpoint di rispettivo controllo di qualità sono sulla destra.
La morfologia delle cellule il giorno della raccolta per indifferenziato (Figura 3A) e differenz...

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Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolare, sequenziamento e analisi dei microRNA extracellulari dalle cellule staminali mesenchimali umane

Questo protocollo viene illustrato come purificare i microRNA extracellulari da terreni di coltura cellulare per piccoli RNA libreria costruzione e sequenziamento di nuova generazione. Vari punti di controllo di controllo di qualità sono descritti per permettere ai lettori di capire cosa aspettarsi quando si lavora con campioni di ingresso bassi come exRNAs.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Questo è il primo articolo che affronta problemi tecnici nel sequenziamento di piccoli RNA derivati da vescicole extracellulari dalle cellule. I campioni NGS richiedono una preparazione rigorosa e un controllo di qualità. A causa della natura dei veicoli elettrici, il processo qc dei campioni di veicoli elettrici si discosta dalla norma.Il vantaggio di questo protocollo sono i passaggi qc in esso per gli utenti per la prima volta. A dimostrare la procedura sarà Junyi Su, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Per cominciare, placcare le cellule staminali mesenchimali umane a 2.000 cellule per centimetro quadrato in supporti MSC freschi in cinque contenitori T175.Quindi far crescere le cellule a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5% e sostituire il supporto ogni due o tre giorni, fino a ottenere cinque fiasche di cellule confluenti al 90%. Quindi, lavare le cellule tre volte con 20 millilitri di PBS per pallone. Aggiungere 20 millilitri di supporti di raccolta EV in ogni pallone.E incubarli a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5% per 48 ore. Raccogliere il supporto e centrifugarlo per 10 minuti a 300 g e quattro gradi Celsius. Quindi raccogliere il supernatante e centrifugare il supporto per 20 minuti a 2.000 g e quattro gradi Celsius.Raccogli di nuovo il supernatante e centrifuga il supporto per 30 minuti a 15, 500 g e quattro gradi Celsius. Raccogli il supernatante per l'ultima volta. Successivamente, trasferire il supporto su tubi ultracentrifugo.Qui viene utilizzato un rotore ad angolo fisso da 60Ti e il pellet verrà ancorato al lato del tubo. Contrassegnare il lato del coperchio in cui è previsto il pellet e disegnare un cerchio sul lato del tubo in cui è previsto il pellet. E pellettare gli exRNA per 90 minuti a 100.000 g e quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione finale, rimuovere il supernatante. Utilizzare piccoli pezzi di carta assorbente per asciugare l'interno del tubo senza toccare il fondo del tubo. E poi invertire il tubo su una carta assorbente.Per rimospendare il pellet, aggiungere 200 microlitri di PBS in ogni tubo e vortice il tubo per 30 secondi. Pipetta su e giù 20 volte. Quindi valutare le vescicole extracellulari e altre biomolecole con analisi di tracciamento delle nanoparticelle.E conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriori esperimenti. Dopo aver scongelato i campioni, utilizzare un kit di isolamento dell'RNA per estrarre l'RNA secondo il protocollo del produttore. Elute l'RNA dalla colonna fornita nel kit di isolamento dell'RNA in 100 microlitri di acqua priva di RNAse.Per concentrare l'RNA attraverso la precipitazione dell'etanolo, aggiungere un microlitro di glicogeno, 10 microlitri di acetato di sodio a due molari pH-5,5 e 250 microlitri di etanolo prerimente refrigerato al 99% in 100 microlitri dell'RNA purificato. Quindi incubare i campioni a meno 20 gradi Celsius durante la notte per far precipitare l'RNA. Per pellettare l'RNA, centrifugare per 20 minuti a 16.000 g e quattro gradi Celsius.Quindi, rimuovere il supernatante e lavare il pellet di RNA con un millilitro di 75% di etanolo. Centrifugare di nuovo per cinque minuti a 16.000 g e quattro gradi Celsius per pellettare l'RNA. Rimuovere l'etanolo e lasciare aperto il coperchio del tubo dell'RNA per cinque-10 minuti per asciugare all'aria il pellet di RNA.Rimescolare il pellet di RNA in sette microlitri di acqua priva di RNAse e utilizzare una macchina per l'elettroforesi capillare a base di chip per rilevare la qualità e la concentrazione dell'RNA. Per iniziare la costruzione della libreria, pipettare cinque microlitri dell'RNA in un tubo PCR pre-refrigerato da 0,2 millilitri. Successivamente, diluire gli adattatori da 3' in acqua priva di RNAse con un rapporto volume uno-a-10.Aggiungere 0,5 microlitri dell'adattatore diluito nel tubo dell'RNA e pipettare la miscela su e giù otto volte. Centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo. Incubare la miscela di adattatori RNA a 70 gradi Celsius per due minuti in un ciclore termico preriscaldato.E poi riposizionare il campione sul blocco refrigerato. Successivamente, aggiungere un microlitro del buffer di legatura, 0,5 microlitri dell'inibitore della RNAse e 0,5 microlitri della ligasi dell'RNA T4 nella miscela dell'adattatore di RNA. Pipetta su e giù otto volte, e centrifugare brevemente.Quindi incubare il tubo a 28 gradi Celsius per un'ora nel ciclore termico preriscaldato. Successivamente, aggiungere 0,5 microlitri della soluzione di arresto nel tubo campione, con il tubo che rimane nel ciclore termico. Pipettare su e giù otto volte e continuare a incubare a 28 gradi Celsius per 15 minuti.Diluire gli adattatori da 5'in acqua priva di RNA con un rapporto volume uno-a-10. Aggiungere 0,5 microlitri dell'adattatore diluito in un tubo PCR separato da 0,2 millilitri. Riscaldare l'adattatore 5 a 70 gradi Celsius per due minuti.E poi posizionare il campione sul blocco refrigerato. Aggiungere 0,5 microlitri di ATP da 10 nanomol e 0,5 microlitri della ligasi dell'RNA T4 al tubo adattatore da 5'. Pipetta su e giù otto volte.E centrifugare brevemente per raccogliere tutti i liquidi nel fondo. Quindi, aggiungere 1,5 microlitri della miscela di adattatori da 5' nel campione di RNA. Pipettare otto volte molto delicatamente e incubare il campione a 28 gradi Celsius per un'ora.Per ottenere cDNA, diluire il primer inverso della transcriptasi in acqua priva di RNAse con un rapporto di volume uno-a-10. Aggiungere 0,5 microlitri del primer diluito nel campione di RNA, pipettare otto volte molto delicatamente e centrifugare brevemente. Quindi incubare l'RNA e la miscela di primer a 70 gradi Celsius per due minuti nel ciclore termico preriscaldato.E poi posizionare il campione su un blocco refrigerato. Successivamente, aggiungere un microlitro di 5X First Strand Buffer, 0,5 microlitri di miscela DNTP da 12,5 millimolare, 0,5 microlitri di DTT da 100 millimolare, 0,5 microlitri di inibitore della RNAse e 0,5 microlitri di trascrittasi inversa nel tubo del campione. Pipetta otto volte molto delicatamente.E centrifugare brevemente. Incubare il campione a 50 gradi Celsius per un'ora nel ciclore termico preriscaldato. Successivamente, aggiungere 4,25 microlitri di acqua ultrapura, 12,5 microlitri del mix PCR, un microlitro del primer indice e un microlitro del primer universale nel campione cDNA.Pipetta su e giù otto volte, e centrifugare brevemente. Infine, posizionare il campione in un ciclore termico e impostare il ciclore in base al manoscritto. Per purificare la libreria di RNA, utilizzare un frazionatore automatizzato delle dimensioni del DNA per elutare le bande tra 140 e 160 coppie di basi.Esegui la libreria estratta su un kit di purificazione PCR basato su colonne ed eludi la libreria in 10 microlitri di acqua priva di RNAse. Per controllare le dimensioni della libreria, caricare un microlitro della libreria purificata su un chip DNA e seguire il protocollo del produttore. Per quantificare la concentrazione della libreria, diluire prima un microlitro della libreria purificata in pH-8.0 Tris-Hcl da 10 millimolare con 0,05% di polisorbato 20 con un rapporto volume uno-a-1.000.Quindi eseguire QPCR utilizzando gli standard dna del kit di quantificazione della biblioteca commerciale. Infine, raggruppare quantità uguali delle librerie in base ai requisiti della macchina di sequenziamento e sequenza su un sistema di sequenziamento ad alta velocità effettiva. L'elettroferogramma degli RNA extracellulari includeva una vasta gamma di RNA.Al contrario, l'RNA cellulare ha mostrato picchi molto distinti, corrispondenti a 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA e 28SrRNA. La qualità risultante di entrambe le biblioteche era elevata e comparabile. La distribuzione della lunghezza di entrambe le librerie ha mostrato un singolo picco a 22 nucleotidi, correlato con i microRNA.Al contrario, le librerie degli RNA extracellulari erano più eterogenee, e contenevano altri due picchi correlati con tRNA, metà e frammenti, o piRNA. Il 65% delle letture dall'RNA cellulare sono state mappate ai microRNA umani e ciascuna delle altre piccole RNA rappresentava una piccola parte delle letture mappate. Al contrario, solo l'8% degli RNA extracellulari corrispondeva ai microRNA umani.Il piccolo RNA più abbondante a cui sono state mappate le letture erano tRNA, e le letture ineguagliate in seguito corrispondevano a sequenze batteriche. Un confronto con il genoma bovino ha suggerito che fbs non era una fonte di contaminazione. Quindi, gli RNA extracellulari mostrano un profilo atipico rispetto al normale RNA cellulare.La preparazione della biblioteca è una parte cruciale di questo protocollo. La miscelazione deve essere eseguita molto delicatamente per evitare la formazione di bolle. Questo metodo può anche essere utilizzato per indagare il profilo degli exRNA di altri tipi di cellule, il che aiuta a studiare la funzione degli exRNA.

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Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...