Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
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その技術支援の稲野に氏クロース バスとさんリタ ローゼンダール タンペレに感謝しております。博士ダニエル Otzen 彼の超遠心機の頻繁な使用を許可するために感謝します。本研究は、技術革新基金デンマーク (召集プロジェクト) によって支えられました。

注: 間葉系幹細胞用成長培地 (メディア)材料の表に示すように事前に用意しています。
1. 細胞培養
注: ヒト間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織または他のソースの11から入手できます。また、hMSCs はサプライヤーから購入できます。このプロトコルで使われる BMSCs いた患者の骨髄から派生し、会社から買った。
<ol><li>1 x ...

<ol>
	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. 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ここでは、低入力サンプルから発現解析を可能にする exRNAs の次世代シーケンシングのためのプロトコルについて述べる。でも小さな変化 (すなわち、遠心ステップまたはローターの種類の変更) はトランスクリプトームに影響を与えるために miRNA レベル13,14EV と exRNA の分離のための特定のプロトコルに従うことが重要です。したがって、どのよう?...

細胞外と Rna (exRNAs) を循環、様々 な体液に存在 RNases1,2の方が抵抗力があります。その高い豊富、安定性とアクセシビリティのやすさ3診断と予後マーカーとしての臨床的評価のために魅力的です。ExRNAs のための輸送のモードには細胞小胞 (Ev)、リポタンパク質 (高密度リポタンパク質; などとの関連付けが含まれますHDL) とリボ核蛋白質複合体 (よう Argonaute2 錯体を)4。
ExRNAs のサブセットが小さい非コーディングの Rna 約 22 であるマイクロ Rna (Mirna)、転写後の遺伝子発現を調節する nt。Ex miRNAs は、細胞間コミュニケーションと5セルの恒常性の調節に関与しています。たとえば、HDL は内皮細胞接着分子 1 (ICAM-1) を抑制するために ex ミール 223 を提供および炎症6。興味深いことに、ミール 223 も肺癌細胞より侵襲性の表現型7を取ることをプログラミングする白血球細胞小胞で運ば見られています。したがって、様々 な体液や細胞培養液から ex miRNAs のトランスクリプトーム、ex miRNA がシグナル伝達の私達の理解が向上します。
小さな RNA シーケンス (小さな RNA seq) は、小さな rna トランスクリプトームを理解するための強力なツールです。発現の知られている Rna の中の異なるサンプルを比較できるだけでなく新規低分子 Rna はまた検出し特徴付けられます。その結果、それはまた異なる条件下での発現の Mirna を識別するために堅牢な方法です。しかし、小さな RNA seq のハードルの一つは髄液、唾液、尿、牛乳の血清、培地のような低 exRNA 入力流体から小さな RNA seq ライブラリを生成するの困難です。イルミナから TruSeq 小さな RNA 図書館準備プロトコルは、高品質の総 RNA の約 1 μ g を必要と、ニュー イングランド biolabs 社から NEBNext 小型 RNA ライブラリの準備のセットのプロトコルが RNA8,9の 100 ng 1 μ g を必要とします。多くの場合、これらのサンプルからの総 RNA は従来の紫外可視分光光度計の検出限界以下です。
Ex miRNAs 由来の体液は、潜在的によい予後および診断マーカーです。ただし、機能への影響を研究するためにまたは特定の ex miRNAs の起源を決定するため、細胞培養システムが代わりに使用よくされます。EVs は、心筋梗塞、アルツハイマー病、移植片対宿主病の10を含む多くの疾患を軽減することに関与しているために、間葉系幹細胞 (MSCs) を盛んに研究されています。ここでは、骨髄由来 Msc (BMSCs) と小さな RNA 図書館の建設、シーケンスとデータ解析 (図 1) を最適化するために使用する特定の手順から ex miRNAs の浄化を示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

細胞外と循環の Rna (exRNA) と体の多くの細胞タイプによって生産されて唾、血漿、血清、牛乳、尿など多数の体液に存在します。これらの Rna の 1 つのサブセットは、転写レギュレータ-マイクロ Rna (Mirna) です。特定の細胞のタイプによって生成される miRNAs の線引き、体外培養システムを収穫する使用ことができます、プロファイル exRNAs が 1 つのセルのサブセットから派生しました。間葉系幹細胞の分泌因子は数多くの疾患を軽減することに関与している、ここでの in vitro モデル システムとして使用されます。本稿では、コレクションのプロセスは、小さな RNA の精製とシーケンス細胞外 miRNAs にライブラリを生成をについて説明します。文化メディアから ExRNAs は細胞 RNA から最適化されたプロシージャの呼び出し、RNA の低入力サンプルをされているによって異なります。このプロトコルは、exRNA の精製とシーケンス中に各段階で品質管理のチェックポイントを示す文化メディアから小さな exRNA シーケンスに包括的なガイドを提供します。

このプロトコルで説明する方法は、次世代シーケンシングの MSC 文化から exRNA を収集するために最適です。左の図 1は、ワークフローの全体的なスキームとそれぞれ品質管理チェックポイントには右側に。
コレクションの日に細胞の形態 (図 3 a) 未分化し、区別される (<strong cla...

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Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

このプロトコルは、小さな RNA ライブラリーの構築と次世代シーケンシングのための細胞培養媒体からマイクロ Rna は細胞を浄化する方法を示します。さまざまな品質管理のチェックポイントは、exRNAs のような低入力サンプルを操作するときに期待するものを理解する読者を許可するように記述されています。

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

これは、細胞から細胞外小胞に由来する小さなRNAの配列決定における技術的な問題に対処する最初の論文です。NGS サンプルには、厳格な準備と品質管理が必要です。EVの性質上、EVサンプルのQCプロセスは標準から逸脱しています。このプロトコルの利点は、初めてのユーザのためのQCステップです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究助手であるJunyi Suです。まず、5つのT175フラスコに新鮮なMSC培地で2,000細胞/平方センチメートルのヒト間葉系幹細胞をプレートします。その後、5%の二酸化炭素環境で摂氏37度で細胞を増殖させ、90%コンフルエント細胞の5フラスコが得られるまで、2〜3日ごとに培地を交換する。次に、フラスコあたり20ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄する。各フラスコに20ミリリットルのEV回収培地を加えます。そして、5%の二酸化炭素環境で摂氏37度で48時間インキュベートします。メディアを収集し、300グラムと摂氏4度で10分間遠心分離機。その後、上清を収集し、2,000グラムと摂氏4度で20分間遠心分離機。再び上澄み物を収集し、15、500グラムと摂氏4度で30分間メディアを遠心分離します。最後の時間の上清を収集します。次に、超遠心チューブにメディアを移します。ここでは60Ti固定角度ローターを使用し、ペレットはチューブの側面に固定されます。ペレットが予想される蓋の側面をマークし、ペレットが予想されるチューブの側面に円を描きます。そして、100、000グラムおよび摂氏4度で90分間exRNAをペレットする。最終的な遠心分離の後、上清を取り除く。チューブの底部に触れることなくチューブの内側を乾燥させるために吸収性の紙の小片を使用してください。そして、吸収性紙の上にチューブを反転します。ペレットを再懸濁するには、各チューブに200マイクロリットルのPBSを加え、チューブを30秒間渦出させます。ピペットは20回上下します。次に、ナノ粒子追跡解析で細胞外小胞やその他の生体分子を評価します。そして、さらなる実験までマイナス80度でペレットを保管してください。サンプルを解凍した後、RNA分離キットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってRNAを抽出します。RNA分離キットに用意されているカラムからRNAを100マイクロリットルのRNAAseフリー水で溶出させます。エタノール沈殿を通してRNAを濃縮するには、グリコーゲン1マイクロリットル、2モルpH-5.5酢酸ナトリウム10マイクロリットル、および250マイクロリットルの予冷99%エタノールを精製RNAの100マイクロリットルに加えます。その後、RNAを沈殿させるために一晩マイナス20度でサンプルをインキュベートします。RNAをペレット化するには、16,000gおよび摂氏4度で20分間遠心分離機を用いた。次に上清を取り除き、75%エタノールの1ミリリットルでRNAペレットを洗浄する。再び16,000gと4°Cで5分間遠心分離機を使用してRNAをペレット化する。エタノールを取り出し、RNAチューブの蓋を5~10分間開いたままにして、RNAペレットを空気乾燥させます。RNAペレットを7マイクロリットルのRNAAseフリー水で再懸濁し、チップベースのキャピラリー電気泳動機を使用してRNAの品質と濃度を検出します。ライブラリーの構築を開始するために、5マイクロリットルのRNAを、あらかじめ冷蔵した0.2ミリリットルのPCRチューブに入れます。次に、RNAseフリー水の3'アダプターを1対10の体積比で希釈します。希釈したアダプターの0.5マイクロリットルをRNAチューブに加え、混合物を上下に8回ピペットします。チューブの底にあるすべての液体を収集するために簡単に遠心分離機。RNAアダプター混合物を摂氏70度で2分間、予熱熱サイクラーでインキュベートします。そして、冷やしたブロックにサンプルを戻します。次に、ライゲーションバッファーの 1 マイクロリットル、RNAse 阻害剤の 0.5 マイクロリットル、および 0.5 マイクロリットルの T4 RNA リガーゼを RNA アダプター混合物に加えます。ピペットは8回上下し、遠心分離機は短時間。その後、予熱サーマルサイクラーで1時間摂氏28度でチューブをインキュベートします。次に、0.5マイクロリットルのストップ溶液をサンプルチューブに加え、チューブをサーマルサイクラーに留めます。ピペットは8回上下し、摂氏28度で15分間インキュベートを続けます。RNAseフリーウォーターに5'アダプターを1対10の体積比で希釈します。希釈したアダプターの 0.5 マイクロリットルを別の 0.2 ミリリットル PCR チューブに加えます。5'アダプターを摂氏70度で2分間加熱します。そして、冷やしたブロックの上にサンプルを置きます。10ナノモルATPの0.5マイクロリットルとT4 RNAリガーゼの0.5マイクロリットルを5'アダプターチューブに加えます。ピペットは8回上下します。そして、遠心分離機は底にすべての液体を収集するために簡単に。次に、5'アダプター混合物の1.5マイクロリットルをRNAサンプルに加えます。ピペットは非常に穏やかに8回、そして1時間摂氏28度でサンプルをインキュベートします。cDNAを得るために、RNAAseフリー水中の逆転写酵素プライマーを1対10の体積比で希釈します。希釈したプライマーを0.5マイクロリットルをRNAサンプルに加え、ピペットを8回非常に穏やかに加え、遠心分離機を短時間加えます。その後、RNAとプライマー混合物を摂氏70度で2分間煮込んだ。そして、冷やしたブロックの上にサンプルを置きます。次に、5Xファーストストランドバッファーの1マイクロリットル、0.5マイクロリットルの12.5ミリモルDNTP混合物、0.5マイクロリットルの100ミリモルDTT、0.5マイクロリットルのRNAAse阻害剤、および0.5マイクロリットルの逆転写酵素をサンプルチューブに加えます。ピペット8回非常に穏やか。そして、遠心分離機は簡単に。予熱サーマルサイクラーで1時間、摂氏50度でサンプルをインキュベートします。次に、4.25マイクロリットルの超純水、12.5マイクロリットルのPCRミックス、インデックスプライマーの1マイクロリットル、ユニバーサルプライマーの1マイクロリットルをcDNAサンプルに加えます。ピペットは8回上下し、遠心分離機は短時間。最後に、サンプルをサーマルサイクラーに入れ、原稿に従ってサイクラーをセットアップします。RNAライブラリを精製するには、自動DNAサイズの分量化器を使用して、140から160の塩基対の間のバンドを溶出させます。抽出したライブラリーをカラムベースのPCR精製キットで実行し、10マイクロリットルのRNAAseフリー水でライブラリを溶出します。ライブラリのサイズを確認するには、精製されたライブラリの1マイクロリットルをDNAチップにロードし、メーカーのプロトコルに従ってください。ライブラリ濃度を定量化するには、まず1対1、000体積比で0.05%ポリソルベート20で10ミリモルpH-8.0 Tris-Hclで精製されたライブラリの1マイクロリットルを希釈します。次に、市販ライブラリ定量キットのDNA規格を使用してQPCRを実行します。最後に、シーケンスマシンの要件に応じてライブラリの量を均等にプールし、ハイスループットシーケンシングシステムでシーケンスを行います。細胞外RNAの電解液は広範囲のRNAを含んでいた。対照的に、細胞RNAは、5StRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、および28SrRNAに対応する非常に明確なピークを示した。両方のライブラリの結果の品質は高く、同等でした。両方のライブラリーの長さの分布は、マイクロRNAと相関する22ヌクレオチドで単一のピークを示した。対照的に、細胞外RNAのライブラリーはより異種であり、tRNA、半分および断片、またはpiRNAと相関する2つのピークを含んでいた。細胞RNAからの読み取りの65%はヒトマイクロRNAにマッピングされ、他の小さなRNAのそれぞれがマッピングされた読み取りのごく一部を占めた。対照的に、細胞外RNAのわずか8%がヒトマイクロRNAと一致した。読み取りがマッピングされた最も豊富な小さなRNAはtRNAであり、比類のない読み取りは後に細菌配列に一致した。ウシのゲノムとの比較は、FBSが汚染源ではないことを示唆した。したがって、細胞外RNAは、通常の細胞RNAと比較して非定型プロファイルを示す。ライブラリの準備は、このプロトコルの重要な部分です。混合は、泡が形成されるのを避けるために非常に穏やかに行われなければなりません。この方法は、他の種類の細胞からのexRNAのプロファイルを調べるのにも使用でき、exRNAの機能を研究するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...