Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

우리는 그들의 기술 지원에 대 한 iNANO에 감사 미스터 클로스 버스 하 양 리 타 Rosendahl입니다. 그의 ultracentrifuge의 빈번한 사용을 허용에 대 한 특별 박사 다니엘 Otzen 감사 합니다. 이 연구는 혁신 기금 덴마크 (소집 프로젝트)에 의해 지원 되었다.

참고: 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSC 미디어)은 재료의 테이블에에서 표시 된 대로 미리 준비가 되어 있습니다.
1. 세포 배양
참고: 인간 중간 엽 줄기 세포는 골 수, 지방 조직 또는 다른 소스11에서 얻어질 수 있다. 양자 택일로, hMSCs는 공급 업체를 통해 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 BMSCs는 환자의 골 수?...

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	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update.">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances,+challenges,+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology:+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop.">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li><li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018)</li><li>. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1&#8211;48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018)</li><li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles.">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li><li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+-+current+trends+and+future+prospective.">Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective.</a> Bioscience Reports. 35 (2), (2015).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Methods+of+Choice+for+Extracellular+Vesicles+(EVs)+Characterization.">The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data.">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li><li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomal-miRNAs+are+critical+factors+for+inducing+anti-proliferation+signalling+to+A2780+and+SKOV-3+ovarian+cancer+cells.">Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 38498 (2016).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Asghar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomonas+sp+is+a+Novel+Cell+Culture+Contaminant.">Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).</li></ol>

여기, 우리는 낮은 입력된 샘플에서 차동 식 분석을 가능 하 게 exRNAs의 다음 세대 시퀀싱에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 심지어 작은 변경 (즉, ultracentrifugation 단계 또는 회전자 유형 변경)는 transcriptome 영향을 미칠 수 있기 때문에 miRNA 레벨13,14EV 및 exRNA 격리에 대 한 특정 프로토콜을 준수 하는 것이 중요 합니다. 따라서, 어떻게는 exRNA는 절연, 결과 ?...

세포 외 및 순환 RNAs (exRNAs) 다양 한 체액에 존재 하 고 저항 RNases1,2쪽으로 있습니다. 그들의 높은 풍부, 안정성과 접근의 용이성 진단 및 예 후 마커3임상 평가 대 한 매력이 있습니다. ExRNAs에 대 한 전송 모드 포함 extracellular 소포 (EVs), 단백질 (예: 고밀도 지 단백;와 협회 HDL) 및 ribonucleoprotein 단지 (와 같은 Argonaute2 단지와 함께)4.
ExRNAs의 하위 집합은 작은 비 코딩 RNAs의 약 22 microRNAs (miRNAs), nt posttranscriptional 유전자 발현을 조절 하는. 전 miRNAs 셀 통신 및 세포 항상성5의 규칙에 연루 되었습니다. HDL 전-미르-223 내 피 세포 세포 접착 분자 1 (ICAM-1)를 억 누르기 위해 제공 하는 예를 들어와 염증을6. 흥미롭게도, 미르-223는 또한 더 많은 침략 형7에 그들을 프로그래밍 하는 폐 암 세포를 백혈구에서 extracellular 소포에 의해 수송 여겨진다. 따라서, 다양 한 체액 및 세포 배양 매체에서 전 miRNAs의 transcriptome 크게 전 미르 신호에 대 한 우리의 이해를 향상 됩니다.
작은 RNA 시퀀싱 (작은 RNA seq) 작은 RNAs의 transcriptomics를 이해 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 뿐만 아니라 다른 샘플 차동 표현된 알려진된 RNAs 사이 비교 될 수 있다 하지만 소설 작은 RNAs 수 또한 감지 하 고 특징. 따라서, 그것은 또한 다른 조건 하에서 차동 표현된 miRNAs 식별 하는 강력한 방법입니다. 그러나, 작은 RNA seq의 장애물 중 하나는 뇌 척수의 체액, 타 액, 소변, 우유, 혈 청 및 문화 미디어 같은 낮은 exRNA 입력된 액체에서 작은 RNA seq 라이브러리 생성 어려움입니다. TruSeq 작은 RNA 라이브러리 준비 프로토콜 Illumina에서 고품질 총 RNA의 약 1 µ g 필요 하며 뉴 잉글랜드 Biolabs에서 NEBNext 작은 RNA 라이브러리 준비 설정 프로토콜 100 ng-1 µ g의 RNA8,9. 때때로, 이러한 샘플에서 총 RNA 기존의 대 한 UV 광에 대 한 검출 한계 같습니다.
체액에서 파생 된 전 miRNAs는 잠재적으로 좋은 전조와 진단 마커. 그러나, 기능 효과 연구 하거나 특정 전 miRNAs의 원산지 결정, 세포 배양 시스템 자주 대신 사용 됩니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 그들의 EVs 심근 경색, Alzheimer의 질병과 접 붙이다 비교 호스트 질병10를 포함 하 여 많은 질병을 경감에 연루 되어 있기 때문에 광범위 하 게 연구 되었습니다 있다. 여기, 우리 골 수 파생 된 MSCs (BMSCs)와 작은 RNA 도서관 건설, 시퀀싱 및 데이터 분석 (그림 1)을 최적화 하는 데 사용 하는 특정 단계에서 전 miRNAs의 정화를 보여 줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

세포 외 및 순환 RNAs (exRNA)는 신체의 많은 세포 유형에 의해 생산과 타 액, 혈장, 혈 청, 우유와 소변 등 수많은 체액에 존재. 이러한 RNAs의 한 하위 집합은 posttranscriptional 레 귤 레이 터-microRNAs (miRNAs). 특정 세포 유형에 의해 생산 하는 miRNAs의 윤곽을 그리 다 생체 외에서 문화 시스템 수확 사용할 수와 프로필 exRNAs 셀의 한 하위 집합에서 파생 된. 중간 엽 줄기 세포의 secreted 요소 경감 수많은 질병에 연루 되 고 여기에 체 외 모델 시스템으로 사용 된다. 이 문서 수집의 과정, 작은 RNA의 정화 및 시퀀스 extracellular miRNAs에 라이브러리 생성에 설명합니다. 문화 미디어에서 ExRNAs 낮은 RNA 입력된 샘플, 최적화 된 프로시저를 호출 하 여 세포질 RNA에서 다. 이 프로토콜에 포괄적인 가이드를 작은 exRNA 시퀀싱 문화 미디어에서 exRNA 정화 및 시퀀싱 하는 동안 각 단계에서 품질 관리 검사점을 보여주는 제공 합니다.

이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 다음 세대 시퀀싱 MSC 문화에서 exRNA 수집 최적화 됩니다. 워크플로의 전체 체계는 그림 1 에 왼쪽에 있으며 각각 품질 관리 검사점 오른쪽에.
컬렉션에 대 한의 날에 세포의 형태학 undifferentiated (그림 3A)와 (그림 3B) 분화 세포 ...

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Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

이것은 세포에서 세포 외 소포에서 파생된 작은 RNA를 시퀀싱하는 기술적 문제를 해결하는 첫 번째 논문입니다. NGS 샘플은 엄격한 준비 와 품질 관리가 필요합니다. EV의 특성으로 인해 EV 샘플의 QC 프로세스는 표준에서 벗어나게 됩니다.이 프로토콜의 장점은 처음 사용자를 위한 QC 단계입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 조수 인 준이 수입니다. 시작하려면, 5개의 T175 플라스크에서 신선한 MSC 매체에서 2, 000 평방 센티미터 당 세포2, 000 세포에서 인간 중간엽 줄기 세포를 플레이트.그런 다음 5%의 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 세포를 성장시키고 90%의 콘부유성 세포의 5플라스크가 얻어지을 때까지 2~3일마다 미디어를 대체한다. 다음으로 플라스크 당 PBS 20 밀리리터로 셀을 세 번 씻으세요. 각 플라스크에 EV 수집 미디어 20밀리리터를 추가합니다.그리고 48 시간 동안 5 %의 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 미디어를 수집하고 원심 분리기는 섭씨 300g과 섭씨 4도에서 10분 동안 수집합니다. 그런 다음 상체를 수집하고 2, 000g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 미디어를 원심 분리합니다.상체를 다시 수집하고, 15, 500 g 및 섭씨 4도에서 30 분 동안 미디어를 원심 분리합니다. 마지막으로 상체를 수집합니다. 다음으로 미디어를 초원심분리기 튜브로 전송합니다.60Ti 고정 각도 로터가 여기에 사용되며 펠릿은 튜브 측면에 고정됩니다. 펠릿이 예상되는 뚜껑의 측면을 표시하고 펠릿이 예상되는 튜브 측면에 원을 그립니다. 그리고 100, 000g 및 섭씨 4도에서 90 분 동안 exRNA를 펠렛.최종 원심 분리 후, 상체를 제거합니다. 튜브의 바닥을 만지지 않고 튜브 의 내부를 건조 흡수 용지의 작은 조각을 사용합니다. 그리고 흡수성 용지에 튜브를 반전.펠릿을 다시 중단하려면 각 튜브에 200 마이크로리터를 추가하고 튜브를 30초 동안 소용돌이치십시오. 파이펫을 20번 위아래로 바침합니다. 그런 다음 나노 입자 추적 분석을 통해 세포 외 소포 및 기타 생체 분자를 평가합니다.그리고 추가 실험이 될 때까지 펠릿을 영하 80도에 보관하십시오. 시료를 해동한 후, RNA 절연 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다. RNA 분리 키트에 제공된 열에서 RNA를 100 마이크로리터에 RNA가 없는 물로 엘테.에탄올 강수화를 통해 RNA를 농축하려면 글리코겐 1마이크로리터, 2-연체pH-5.5 나트륨 아세테이트 10마이크로리터, 정제된 RNA의 100마이크로리터에 미리 냉각된 99%에탄올 250마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 RNA를 침전시키기 위해 하룻밤 사이에 영하 20도에서 샘플을 배양합니다. RNA를 펠릿하기 위해 원심분리기는 16, 000g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심분리기를 합니다.다음으로, 상체를 제거하고 RNA 펠릿을 75%의 1밀리리터로 세척한다. 원심분리기는 16, 000g 및 4°C에서 5분 동안 다시 RNA를 펠릿합니다. 에탄올을 제거하고 RNA 튜브의 뚜껑을 5-10분 동안 열어 RNA 펠릿을 공기 건조시 둡니다.RNA 펠릿을 RNA 가 없는 7개의 마이크로리터에서 재중단하고 칩 기반 모세관 전기포고증 기계를 사용하여 RNA 품질 과 농도를 감지합니다. 라이브러리 구조를 시작하기 위해 RNA의 5 마이크로리터를 냉각 된 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 피펫합니다. 다음으로, 3'어댑터를 1대 10 부피 비율로 RNA가 없는 물에 희석합니다.희석된 어댑터의 0.5 마이크로리터를 RNA 튜브에 넣고 혼합물을 8번 위아래로 피펫합니다. 원심 분리기는 튜브 의 바닥에있는 모든 액체를 수집하기 위해 간단히합니다. 예열된 열 사이클러에서 RNA 어댑터 혼합물을 섭씨 70도에서 2분간 배양합니다.그런 다음 샘플을 차가운 블록에 다시 놓습니다. 다음으로, 렌지 버퍼의 마이크로리터 1개, RNAse 억제제의 0.5 마이크로리터, 및 T4 RNA 리구아제의 0.5 마이크로리터를 RNA 어댑터 혼합물에 첨가한다. 피펫을 8번 위아래로, 원심분리기는 간단히 말했습니다.그런 다음 예열 된 열 사이클러에서 1 시간 동안 28도에서 튜브를 배양합니다. 다음으로, 튜브가 열 사이클러에 머무르면서 시료 튜브에 스톱 용액의 0.5 마이크로리터를 추가합니다. 피펫은 8회 오르내리며 섭씨 28도에서 15분 동안 계속 배양합니다.비약용 5'어댑터를 1대 10 부피 비율로 RNAe 가 없는 물로 희석하십시오. 희석된 어댑터의 0.5 마이크로리터를 별도의 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 넣습니다. 5'어댑터를 섭씨 70도에서 2분간 가열합니다.그런 다음 샘플을 차가운 블록에 놓습니다. T4 RNA 리개갈의 10나노몰 ATP의 0.5 마이크로리터와 0.5 마이크로리터를 5'어댑터 튜브에 추가합니다. 피펫을 위아래로 8번.그리고 원심 분리기는 바닥에 모든 액체를 수집하기 위해 간단히. 다음으로, RNA 샘플에 5'어댑터 혼합물의 1.5 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫은 8번 매우 부드럽게 샘플을 1시간 동안 섭씨 28도에서 배양합니다.cDNA를 얻으려면, 비약체가 없는 물에서 역전사 프라이머를 1대 10 부피 비율로 희석한다. 희석된 프라이머의 0.5 마이크로리터를 RNA 샘플에 넣고, 파이펫8회는 매우 부드럽게, 원심분리기를 간단히 드시면 넣습니다. 그런 다음 예열된 열 순환기에서 2 분 동안 RNA 및 프라이머 혼합물을 섭씨 70도에서 배양합니다.그런 다음 샘플을 차가운 블록에 놓습니다. 다음으로, 5X 퍼스트 스트랜드 버퍼 1편, 12.5밀리머 DNTP 혼합물의 0.5 마이크로리터, 100밀리머 DTT의 0.5 마이크로리터, RNAse 억제제 0.5 마이크로리터, 시료 튜브에 역전사 0.5 마이크로리터를 첨가한다. 파이펫 8 번 매우 부드럽게.그리고 원심분리기는 간단히 말했습니다. 예열된 열 순환기에서 1시간 동안 섭씨 50도에서 샘플을 배양합니다. 다음으로, 초순수 4.25마이크로리터, PCR 믹스의 12.5 마이크로리터, 인덱스 프라이머의 마이크로리터 1개, 범용 프라이머 1마이크로리터를 cDNA 샘플에 넣습니다.피펫을 8번 위아래로, 원심분리기는 간단히 말했습니다. 마지막으로 샘플을 열 사이클러에 배치하고 원고에 따라 사이클러를 설정합니다. RNA 라이브러리를 정화하려면 자동화된 DNA 크기 분획기를 사용하여 140~160개의 기본 쌍 사이의 대역을 유수합니다.기둥 기반 PCR 정화 키트에 추출된 라이브러리를 실행하고, RNAse가 없는 물의 10마이크로리터로 라이브러리를 엘테. 라이브러리의 크기를 확인하려면 정제된 라이브러리의 마이크로리터 1개를 DNA 칩에 로드하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 도서관 농도를 정량화하기 위해 먼저 10밀리머 pH-8.0 Tris-Hcl에서 10밀리머 pH-8.0 Tris-Hcl에서 1대 1, 000 부피 비율로 1마이크로리터를 희석시켰다.그런 다음 상용 라이브러리 정량화 키트의 DNA 표준을 사용하여 QPCR을 실행합니다. 마지막으로 시퀀싱 기계의 요구 사항에 따라 동일한 양의 라이브러리를 풀링하고 처리량이 높은 시퀀싱 시스템에서 시퀀스합니다. 세포 외 RNA의 전엽은 RNA의 넓은 범위를 포함.대조적으로, 세포 RNA는 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA 및 28SrRNA에 대응하는 아주 뚜렷한 피크를 보여주었습니다. 두 라이브러리의 품질은 높고 비교할 수 있었습니다. 두 라이브러리의 길이 분포는 마이크로RNA와 상관 관계가 있는 22개의 뉴클레오티드에서 단일 피크를 보였다.대조적으로, 세포외 RNA의 라이브러리는 더 이질적이었고, tRNA, 반쪽 및 파편 또는 piRNA와 상관 관계가 있는 두 개의 더 많은 피크를 포함했습니다. 세포 RNA에서 읽는 65%는 인간 microRNA에 매핑되었고, 다른 작은 RNA는 매핑된 읽기의 작은 부분을 차지하였다. 대조적으로, 세포외 RNA의 단지 8%는 인간 microRNAs에 일치합니다.판독값이 매핑된 가장 풍부한 작은 RNA는 tRNA였고, 타의 추종을 불허하는 판독은 나중에 세균 성 서열과 일치합니다. 소 게놈에 비교는 FBS가 오염의 근원이 아니었다는 것을 건의했습니다. 따라서, 세포외 RNA는 일반적인 세포 RNA에 비해 비정형 프로파일을 나타낸다.라이브러리 준비는 이 프로토콜의 중요한 부분입니다. 거품이 형성되는 것을 피하기 위해 혼합은 매우 부드럽게 수행해야합니다. 이 방법은 또한 exRNAs의 기능을 공부하는 데 도움이 세포의 다른 종류에서 exRNAs의 프로파일을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

연구

유전학

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...