Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Nós estamos gratos ao Sr. Claus Bus e Sra. Rita Rosendahl em iNANO para sua assistência técnica. Agradecimentos especiais a Dr. Daniel Otzen para permitir que nosso uso frequente dele se. Este estudo foi suportado pelo fundo de inovação Dinamarca (revista projeto).

Nota: O meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (mídia MSC) é preparado antecipadamente conforme indicado na Tabela de materiais.
1. cultura de pilha
Nota: Células-tronco mesenquimais humanas podem ser obtidas da medula óssea, tecido adiposo ou outras fontes de11. Alternativamente, hMSCs podem ser comprados através de um fornecedor. Os BMSCs usados no presente protocolo foram derivadas da medula óssea de pacie...

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	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. 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G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. 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A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data.">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li><li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. 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Aqui, descrevemos um protocolo para o sequenciamento de geração próxima de exRNAs que permite análises de expressão diferencial de amostras de entrada baixas. Aderindo a um protocolo específico para isolamento EV e exRNA é importante porque mesmo pequenas alterações (ou seja, a etapa de ultracentrifugação ou uma mudança no tipo de rotor) podem influenciar a transcriptoma e miRNA níveis13,14. Assim, independentemente de como o exRNA é isolado, é imp...

Extracelular e circulando RNAs (exRNAs) estão presentes em vários fluidos corporais e são resistentes no sentido de RNases1,2. Sua abundância elevada, a estabilidade e a facilidade de acessibilidade são atraentes para avaliação clínica como marcadores de diagnóstico e prognóstico3. O modo de transporte para exRNAs incluir vesículas extracelulares (EVs), associação com lipoproteínas (tais como lipoproteína de alta densidade; HDL) e complexos ribonucleoprotein (tais como com complexos Argonaute2)4.
Um subconjunto de exRNAs são microRNAs (miRNAs), que são pequenos não-codificantes RNAs de cerca de 22 nt que regulam a expressão do gene posttranscriptional. Ex-miRNAs têm sido implicados na comunicação célula-célula e regulação da homeostase de células5. Por exemplo, o HDL entrega ex-miR-223 para células endoteliais para reprimir a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e inflamação6. Curiosamente, miR-223 é também visto transportadas por vesículas extracelulares de leucócitos de células de câncer de pulmão, a fazer uma mais invasivo de fenótipo7programação. Assim, a transcriptoma do ex-miRNAs de vários fluidos corporais e meio de cultura celular grandemente irá melhorar a nossa compreensão de ex-miRNA sinalização.
Pequeno RNA sequenciamento (pequeno RNA seq) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para entender a transcriptomics de RNAs pequeno. Não só podem diferentes amostras ser comparadas entre RNAs conhecidos diferencialmente expressos, mas RNAs pequeno romance também pode ser detectado e caracterizado. Consequentemente, é também um método robusto para identificar os miRNAs diferencialmente expressos em condições diferentes. No entanto, um dos obstáculos do pequeno RNA seq é a dificuldade em gerar pequenas bibliotecas seq de RNA a partir de exRNA baixa entrada fluidos como fluidos cérebro-espinhal, saliva, urina, leite, soro e meios de cultura. O protocolo de TruSeq pequeno RNA biblioteca Prep de Illumina requer aproximadamente 1 µ g de RNA total de alta qualidade e o protocolo de NEBNext pequeno RNA biblioteca Prep conjunto de New England Biolabs requer 100 µ g de ng-1 de RNA8,9. Muitas vezes, o RNA total destas amostras estão abaixo do limite de deteção para convencionais espectrofotômetros UV-vis.
Ex-miRNAs derivados de fluidos corporais são potencialmente bons marcadores de diagnósticos e prognósticos. No entanto, a fim de estudar os efeitos funcionais ou para determinar a origem do ex-miRNAs específicos, sistemas de cultura de células são usados frequentemente em vez disso. Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido estudadas extensivamente porque seus EVs têm sido implicados em aliviar muitas doenças, incluindo infarto do miocárdio, a doença de Alzheimer e doença do enxerto contra hospedeiro10. Aqui, demonstramos a purificação do ex-miRNAs de medula óssea-derivado MSCs (BMSCs) e as etapas específicas usadas para otimizar a construção de biblioteca pequena do RNA, sequenciamento e análise de dados (Figura 1).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

RNAs extracelulares e circulantes (exRNA) são produzidas por muitos tipos de células do corpo e existem em vários fluidos corporais como saliva, plasma, soro, leite e urina. Um subconjunto destes RNAs são os reguladores posttranscriptional – microRNAs (miRNAs). Para delinear os miRNAs produzidos por tipos de células específicas, sistemas de cultura in vitro podem ser usados para colher e perfil exRNAs derivado de um subconjunto de células. Os fatores secretados de células-tronco mesenquimais estão implicados em aliviar a inúmeras doenças e é usado como o sistema de modelo in vitro. Este artigo descreve o processo de coleta, purificação do RNA pequeno e geração de biblioteca para sequência de miRNAs extracelular. ExRNAs de meios de cultura diferem de RNA celular por serem amostras de entrada baixas de RNA, que exige procedimentos otimizados. Este protocolo fornece um guia completo para sequenciamento de pequenas exRNA de meios de cultura, mostrando pontos de verificação de controle de qualidade em cada etapa durante o sequenciamento e purificação de exRNA.

O método descrito neste protocolo é otimizado para coletar exRNA de cultura MSC para sequenciamento de próxima geração. O esquema geral de fluxo de trabalho está na Figura 1 , à esquerda e os pontos de verificação do respectivo controle de qualidade estão à direita.
A morfologia das células no dia da coleta para indiferenciado (Figura 3A) e diferenciados (<s...

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Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas

Este protocolo demonstra como purificar microRNAs extracelular de meios de cultura celular para construção de biblioteca pequena do RNA e a próxima geração de sequenciamento. Vários pontos de verificação de controle de qualidade são descritos para permitir que os leitores a entender o que esperar quando se trabalha com amostras de entrada baixas como exRNAs.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Este é o primeiro artigo que aborda problemas técnicos no sequenciamento de pequenas RNAs derivadas de vesículas extracelulares de células. As amostras de NGS requerem preparação rigorosa e controle de qualidade. Devido à natureza dos EVs, o processo QC das amostras de EV desvia-se da norma.A vantagem deste protocolo é que o QC passos para usuários iniciantes. Demonstrando o procedimento estará Junyi Su, assistente de pesquisa do meu laboratório. Para começar, as células-tronco mesenquimais humanas a 2.000 células por centímetro quadrado em mídia MSC fresca em cinco frascos T175.Em seguida, cresça as células a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% e substitua a mídia a cada dois ou três dias, até que cinco frascos de células 90% confluentes sejam obtidos. Em seguida, lave as células três vezes com 20 mililitros de PBS por frasco. Adicione 20 mililitros de mídia de coleta EV em cada frasco.E incuba-los a 37 graus Celsius em ambiente de 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Colete a mídia e centrífuga por 10 minutos a 300 g e quatro graus Celsius. Em seguida, colete o supernaspe, e centrifugar a mídia por 20 minutos a 2.000 g e quatro graus Celsius.Colete o supernante novamente, e centrifugar a mídia por 30 minutos a 15,500 g e quatro graus Celsius. Pegue o supernatante pela última vez. Em seguida, transfira a mídia para tubos ultracentrifuus.Um rotor de ângulo fixo 60Ti é usado aqui, e a pelota será ancorada na lateral do tubo. Marque o lado da tampa onde a pelota é esperada, e desenhe um círculo na lateral do tubo onde a pelota é esperada. E pelotar as exRNAs por 90 minutos a 100.000 g e 4 graus Celsius.Após a centrifugação final, remova o supernatante. Use pequenos pedaços de papel absorvente para secar o interior do tubo sem tocar na parte inferior do tubo. E então inverter o tubo em um papel absorvente.Para resuspensar a pelota, adicione 200 microliters de PBS em cada tubo, e vórtice do tubo por 30 segundos. Pipeta para cima e para baixo 20 vezes. Em seguida, avalie as vesículas extracelulares e outras biomoléculas com análise de rastreamento de nanopartículas.E armazene a pelota a menos de 80 graus Celsius até mais experimentos. Após descongelar as amostras, use um kit de isolamento de RNA para extrair RNA de acordo com o protocolo do fabricante. Elute o RNA da coluna fornecida no kit de isolamento RNA em 100 microliters de água sem RNAse.Para concentrar o RNA através da precipitação do etanol, adicione um microlitro de glicogênio, 10 microliters de dois molares pH-5,5 acetato de sódio e 250 microliters de 99% de etanol pré-refrigerado em 100 microliters do RNA purificado. Em seguida, incubar as amostras a menos de 20 graus Celsius durante a noite para precipitar o RNA. Para pellet o RNA, centrífuga por 20 minutos a 16.000 g e quatro graus Celsius.Em seguida, remova o supernasce e lave a pelota de RNA com um mililitro de 75% de etanol. Centrifugar novamente por cinco minutos a 16.000 g e quatro graus Celsius para pellet o RNA. Retire o etanol e deixe a tampa do tubo RNA aberta por cinco a 10 minutos para secar o RNA ao ar.Resuspenja a pelota de RNA em sete microlitadores de água sem RNAse, e use uma máquina de eletroforese capilar baseada em chip para detectar a qualidade e concentração do RNA. Para começar a construção da biblioteca, pipeta cinco microliters do RNA em um tubo PCR pré-refrigerado de 0,2 mililitro. Em seguida, diluir 3'adaptadores em água livre de RNAse em uma proporção de volume de um a 10.Adicione 0,5 microliters do adaptador diluído no tubo RNA e pipeta a mistura para cima e para baixo oito vezes. Centrífuga brevemente para coletar todo o líquido na parte inferior do tubo. Incubar a mistura do adaptador RNA a 70 graus Celsius por dois minutos em um ciclor térmico pré-aquecido.E então coloque a amostra de volta no bloco refrigerado. Em seguida, adicione um microliter do buffer de ligadura, 0,5 microliters do inibidor RNAse e 0,5 microliters da liga ligase T4 RNA na mistura do adaptador RNA. Pipeta para cima e para baixo oito vezes, e centrífuga brevemente.Em seguida, incubar o tubo a 28 graus Celsius durante uma hora no ciclo térmico pré-aquecido. Em seguida, adicione 0,5 microliters da solução stop no tubo de amostra, com o tubo permanecendo no ciclofatómpro térmico. Pipeta para cima e para baixo oito vezes, e continuar a incubar a 28 graus Celsius por 15 minutos.Diluir adaptadores de 5''em água livre de RNAse em uma proporção de volume de um a 10. Adicione 0,5 microliters do adaptador diluído em um tubo PCR separado de 0,2 mililitro. Aqueça o adaptador de 5'5 a 70 graus Celsius por dois minutos.E, em seguida, coloque a amostra no bloco refrigerado. Adicione 0,5 microliters de 10 nanomol ATP e 0,5 microliters da liga ligase T4 RNA ao tubo adaptador de 5'. Pipeta para cima e para baixo oito vezes.E centrífuga brevemente para coletar todos os líquidos no fundo. Em seguida, adicione 1,5 microliters da mistura de adaptador de 5''na amostra de RNA. Pipeta oito vezes muito suavemente, e incubar a amostra a 28 graus Celsius por uma hora.Para obter cDNA, diluir o primer de transcriptase reversa em água livre de RNAse em uma proporção de volume de um a 10. Adicione 0,5 microliters do primer diluído na amostra de RNA, pipeta oito vezes muito suavemente e centrífuga brevemente. Em seguida, incubar o RNA e a mistura de primer a 70 graus Celsius por dois minutos no ciclo térmico pré-aquecido.E, em seguida, colocar a amostra em um bloco refrigerado. Em seguida, adicione um microlitr de 5X First Strand Buffer, 0,5 microliters de 12,5 mililitros DNTP mistura, 0,5 microliters de 100-millimolar DTT, 0,5 microliters do inibidor RNAse e 0,5 microliters de transcriptase reversa no tubo de amostra. Pipeta oito vezes muito gentilmente.E centrífuga brevemente. Incubar a amostra a 50 graus Celsius durante uma hora no ciclo térmico pré-aquecido. Em seguida, adicione 4,25 microliters de água ultrauso, 12,5 microliters do mix PCR, um microliter do primer de índice e um microliter do primer universal na amostra cDNA.Pipeta para cima e para baixo oito vezes, e centrífuga brevemente. Finalmente, coloque a amostra em um cicloviário térmico e configure o ciclo cicrário de acordo com o manuscrito. Para purificar a biblioteca RNA, use um fracionador automatizado de tamanho de DNA para elutar as bandas entre 140 e 160 pares de base.Execute a biblioteca extraída em um kit de purificação PCR baseado em coluna, e elute a biblioteca em 10 microliters de água sem RNAse. Para verificar o tamanho da biblioteca, carregue um microliter da biblioteca purificada em um chip de DNA e siga o protocolo do fabricante. Para quantificar a concentração da biblioteca, primeiro dilui um microliter da biblioteca purificada em 10 mililitros pH-8,0 Tris-Hcl com 0,05% polisorbate 20 em uma proporção de volume de 1 a 1.000.Em seguida, execute o QPCR usando os padrões de DNA do kit de quantificação da biblioteca comercial. Finalmente, acumule quantidades iguais das bibliotecas de acordo com os requisitos da máquina de sequenciamento e sequência em um sistema de sequenciamento de alto rendimento. O eletroferograma de RNAs extracelulares incluiu uma ampla gama de RNA.Em contraste, o RNA celular apresentou picos muito distintos, correspondendo ao 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA e 28SrRNA. A qualidade resultante de ambas as bibliotecas foi alta e comparável. A distribuição de comprimento de ambas as bibliotecas mostrou um único pico em 22 nucleotídeos, com correlações com microRNAs.Em contraste, as bibliotecas de RNAs extracelulares eram mais heterogêneas, e continham mais dois picos que se correlacionam com tRNAs, metades e fragmentos, ou piRNAs. 65% das leituras do RNA celular foram mapeadas para microRNAs humanas, e cada uma das outras pequenas RNAs foi responsável por uma pequena parte das leituras mapeadas. Em contraste, apenas 8% das RNAs extracelulares corresponderam às microRNAs humanas.O pequeno RNA mais abundante para o qual as leituras mapeadas foram tRNAs, e as leituras incomparáveis mais tarde corresponderam a sequências bacterianas. Uma comparação com o genoma bovino sugeriu que a FBS não era uma fonte de contaminação. Assim, as RNAs extracelulares exibem um perfil atípico em comparação com o RNA celular normal.A preparação da biblioteca é uma parte crucial deste protocolo. A mistura deve ser feita muito suavemente para evitar que bolhas se formem. Este método também pode ser usado para investigar o perfil de exRNAs de outros tipos de células, o que ajuda a estudar a função de exRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Genética

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Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

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Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

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Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...