Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарны г-н Клаус автобус и г-жа Рита Rosendahl на iNANO за их технической помощи. Особая благодарность д-р Даниэль Otzen позволяя нашим частым использованием его ультрацентрифугирования. Это исследование было поддержано в инновационный фонд Дании (MUSTER проекта).

Примечание: Средство роста мезенхимальных стволовых клеток (MSC СМИ) готовится заранее, как указано в Таблице материалов.
1. клеточная культура
Примечание: Можно получить мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга, жировой ткани или других ис...

<ol>
	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update.">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances,+challenges,+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology:+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop.">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li><li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018)</li><li>. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1&#8211;48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018)</li><li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles.">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li><li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+-+current+trends+and+future+prospective.">Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective.</a> Bioscience Reports. 35 (2), (2015).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Methods+of+Choice+for+Extracellular+Vesicles+(EVs)+Characterization.">The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data.">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li><li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomal-miRNAs+are+critical+factors+for+inducing+anti-proliferation+signalling+to+A2780+and+SKOV-3+ovarian+cancer+cells.">Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 38498 (2016).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Asghar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomonas+sp+is+a+Novel+Cell+Culture+Contaminant.">Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).</li></ol>

Здесь мы описываем протокол для следующего поколения последовательности exRNAs, который позволяет анализ дифференциального выражение от низкого входного образцов. Придерживаясь определенных протоколов для изоляции EV и exRNA важно, потому что даже небольшие изменения (например, шаг ultracentrif...

Внеклеточные и циркулирующих РНК (exRNAs) в различных жидкостях и устойчивы к полиадениновый1,2. Их многочисленность, стабильность и легкость доступа являются привлекательными для клинической оценки как диагностические и прогностические маркеры3. Режим транспорта для exRNAs включают внеклеточного везикулы (EVs), ассоциации с липопротеинов (например липопротеидов высокой плотности; HDL) и рибонуклеопротеида комплексы (такие как с Argonaute2 комплексами)4.
Подмножество exRNAs являются микроРНК (интерферирующим), которые являются небольшие некодирующих РНК из около 22 nt, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционного. Экс адаптивной были причастны к ячейке коммуникации и регуляции гомеостаза клетки5. К примеру, HDL поставляет экс мир-223 эндотелиальных клеток для подавления Межмицеллярная молекула 1 (ICAM-1) и воспаление6. Интересно, что мир-223 рассматривается также перевозимых на внеклеточные везикулы легких раковых клеток, программирование их брать на более инвазивных фенотип7из лейкоцитов. Таким образом транскриптом экс адаптивной различных телесные жидкости и клетки культуры среднего значительно улучшит наше понимание экс miRNA сигнализации.
Некодирующие РНК последовательности (seq малых РНК) является мощным инструментом, который может использоваться для понимания transcriptomics малых РНК. Не только можно сравнить различные образцы среди дифференциально выразил известный РНК, но Роман малых РНК также могут быть обнаружены и характерны. Следовательно это также надежный метод идентификации дифференциально выраженной интерферирующим при различных условиях. Однако одна из трудностей малых РНК seq является трудность в создании малых РНК seq библиотек из низких exRNA ввода жидкостей, таких как спинномозговой жидкости, слюна, моча, молока, сыворотки и культуры средств массовой информации. TruSeq малые РНК библиотека Prep протокол от Illumina требует примерно 1 мкг высокого качества всего РНК и протокол NEBNext малых РНК библиотека Prep набор из Новой Англии Biolabs требует 100 нг-1 мкг РНК8,9. Зачастую всего РНК из этих образцов находятся ниже предела обнаружения для обычных-УФ Вид спектрофотометры.
Экс адаптивной производным от жидкостями являются потенциально хорошие диагностических и прогностических маркеров. Однако чтобы изучить функциональные последствия или определить происхождение конкретных экс адаптивной, клетки культуры системы часто используются вместо этого. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) были изучены широко потому, что их EVs были вовлечены в облегчении многих заболеваний, включая инфаркт миокарда, болезни Альцгеймера и трансплантат против принимающей болезни10. Здесь мы демонстрируем очистки экс адаптивной из костного мозга, полученных MSCs (BMSCs) и конкретные шаги, используемые для оптимизации малых РНК библиотека строительства, последовательности и анализ данных (рис. 1).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

Внеклеточные и циркулирующего РНК (exRNA) производятся многие типы клеток организма и существуют в многочисленных телесных жидкостей, таких как слюна, плазмы, сыворотки, молоко и мочи. Одно подмножество этих молекул РНК являются посттранскрипционного регуляторы – микроРНК (интерферирующим). Разграничить адаптивной, производимых типов конкретных клеток, в пробирке культуры системы могут использоваться для сбора и профиль exRNAs, полученных от одного подмножество ячеек. Выделяется факторы мезенхимальных стволовых клеток вовлечены в облегчении многочисленных заболеваний и используется как в пробирке модель системы здесь. Этот документ описывает процесс сбора, очистки малых РНК и библиотека поколения внеклеточного интерферирующим последовательности. ExRNAs от культуры средств массовой информации отличаются от клеточной РНК, будучи низкий входной образцов РНК, которая вызывает для оптимизации процедур. Этот протокол обеспечивает полное руководство для малых exRNA последовательности носителя культуры, показаны контрольно-пропускные пункты контроля качества на каждом этапе во время exRNA очистки и последовательности.

Метод, описанный в настоящем Протоколе оптимизирован для сбора exRNA от MSC культуры для следующего поколения последовательности. Общая схема рабочего процесса на рис. 1 на левой стороне и соответствующего контроля качества контрольно-пропускные пункты н...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

Этот протокол показано, как очистить внеклеточного микроРНК носителя культуры клеток для малых РНК библиотеки строительных и следующего поколения последовательности. Чтобы позволить читателям понять, чего ожидать при работе с низкой ввода образцы как exRNAs описаны различные контрольно-пропускные пункты контроля качества.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Это первый документ, который рассматривает технические проблемы в секвенировании малых РНК, полученных из внеклеточных пузырьков из клеток. Образцы NGS требуют строгой подготовки и контроля качества. Из-за характера EVs, процесс КК образцов EV отклоняется от нормы.Преимуществом этого протокола является КК шаги в этом для впервые пользователей. Демонстрацией процедуры будет Junyi Su, научный сотрудник из моей лаборатории. Для начала пластины человеческих мезенхимальных стволовых клеток на 2000 клеток на квадратный сантиметр в свежих средствах массовой информации MSC в пяти колбы T175.Затем расти клетки при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды и заменить средства массовой информации каждые два-три дня, пока пять колб 90% слияние клеток получены. Затем, мыть клетки три раза с 20 миллилитров PBS на колбу. Добавьте 20 миллилитров средств массовой информации коллекции EV в каждую колбу.И инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды в течение 48 часов. Соберите средства массовой информации и центрифуга его в течение 10 минут при 300 г и четыре градуса по Цельсию. Затем соберите супернатант, и центрифуга средств массовой информации в течение 20 минут при 2000 г и четыре градуса по Цельсию.Соберите супернатант снова, и центрифуга средств массовой информации в течение 30 минут при 15, 500 г и четыре градуса по Цельсию. Соберите супернатант в последний раз. Затем перенесите средства массовой информации в ультрацентрифуговые трубки.Здесь используется ротор с фиксированным углом 60Ti, и гранулы будут закреплены на боковой стороне трубки. Отметйте сторону крышки, где ожидается гранулы, и нарисуйте круг на стороне трубки, где гранулы, как ожидается. И гранулы exRNAs в течение 90 минут при 100 000 г и 4 градуса по Цельсию.После окончательной центрифугации удалите супернатант. Используйте небольшие кусочки абсорбющей бумаги, чтобы высушить внутреннюю часть трубки, не касаясь нижней части трубки. А потом инвертировать трубку на абсорбентной бумаге.Чтобы повторно использовать гранулы, добавьте 200 микролитров PBS в каждую трубку и вихрем трубки в течение 30 секунд. Пипетт вверх и вниз 20 раз. Затем оцените внеклеточные пузырьки и другие биомолекулы с помощью анализа слежения за наночастицами.И хранить гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию до дальнейших экспериментов. После оттаивания образцов используйте комплект изоляции РНК для извлечения РНК в соответствии с протоколом производителя. Elute РНК из колонны, представленной в комплекте изоляции РНК в 100 микролитров без РНАС воды.Чтобы сконцентрировать РНК на этаноловом осадке, добавьте один микролитер гликогена, 10 микролитров двухмолярного рН-5,5 ацетата натрия и 250 микролитров предварительно охлажденного этанола в 100 микролитров очищенной РНК. Затем инкубировать образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию на ночь, чтобы вызвать РНК. Чтобы гранулировать РНК, центрифугу в течение 20 минут при 16 000 г и 4 градусах Цельсия.Затем удалите супернатант и вымойте гранулы РНК одним миллилитром 75%этанола. Центрифуга снова в течение пяти минут при 16 000 г и 4 градуса по Цельсию, чтобы гранулировать РНК. Снимите этанол и оставьте крышку РНК-трубки открытой в течение пяти-десяти минут, чтобы высушить РНК-гранулы.Повторное использование РНК гранул в семи микролитерах воды, свободной от РНК, и использование чип-капиллярной электрофорезной машины для обнаружения качества и концентрации РНК. Чтобы начать строительство библиотеки, пипетка пять микролитров РНК в предварительно охлажденных 0,2-миллилитровый ПЦР трубки. Далее разбавляют 3'адаптеры в безрновой воде при соотношении 1 к 10 объема.Добавьте 0,5 микролитров разбавленного адаптера в РНК-трубку и пипетку смесь вверх и вниз восемь раз. Центрифуга кратко собрать всю жидкость в нижней части трубки. Инкубировать смесь РНК-адаптера при 70 градусах по Цельсию в течение двух минут в разогретом тепловом циклере.А затем поместите образец обратно на охлажденный блок. Затем добавьте в смесь РНК-адаптера один микролитер буфера перевязки, 0,5 микролитров ингибитора РНКазы и 0,5 микролитера РНК-лигазы Т4. Pipette вверх и вниз восемь раз, и центрифуга кратко.Затем инкубировать трубку при 28 градусах по Цельсию в течение одного часа в разогретом тепловом циклере. Затем добавьте 0,5 микролитров стоп-раствора в образец трубки, при этом трубка останется в тепловом циклере. Pipette вверх и вниз восемь раз, и продолжают инкубировать при 28 градусов по Цельсию в течение 15 минут.Разбавить 5'адаптеров в RNAse-свободной воды на один-к-10 объем соотношение. Добавьте 0,5 микролитров разбавленного адаптера в отдельную 0,2-миллилитровую ПЦР-трубку. Нагрейте 5'адаптер при температуре 70 градусов по Цельсию в течение двух минут.А затем поместите образец на охлажденный блок. Добавьте 0,5 микролитров 10-наномольного АТФ и 0,5 микролитров РНК-лигазы T4 в трубку 5'adapter. Пипетт вверх и вниз восемь раз.И центрифуга кратко собрать все жидкости в дно. Затем добавьте в образец РНК 1,5 микролитров смеси 5'adapter. Pipette восемь раз очень мягко, и инкубировать образец при 28 градусов по Цельсию в течение одного часа.Чтобы получить cDNA, разбавить обратную транскриптазу грунтовка в RNAse свободной воды на один-к-10 тома соотношение. Добавьте 0,5 микролитров разбавленной грунтовки в образец РНК, пипетку восемь раз очень осторожно и центрифугу ненадолго. Затем инкубировать РНК и грунтовку смесь при 70 градусах по Цельсию в течение двух минут в разогретом тепловом циклере.А затем поместите образец на охлажденный блок. Затем добавьте в образец пробную трубку один микролитр 5X First Strand Buffer, 0,5 микролитров смеси DNTP 12,5 миллимолярной смеси DNTP, 0,5 микролитров 100-миллимолярной DTT, 0,5 микролитров ингибитора РНАЗ и 0,5 микролитров обратной транскриптазы. Пипетт восемь раз очень мягко.И центрифуга кратко. Инкубировать образец при 50 градусах по Цельсию в течение одного часа в разогретом тепловом циклере. Далее добавьте 4,25 микролитров ультрачистой воды, 12,5 микролитров смеси ПЦР, один микролитр грунтовки индекса и один микролитр универсальной грунтовки в образец кДНК.Pipette вверх и вниз восемь раз, и центрифуга кратко. Наконец, поместите образец в тепловой циклер и установите циклер в соответствии с рукописью. Чтобы очистить библиотеку РНК, используйте автоматический фракционный размер ДНК, чтобы очистить полосы между 140 и 160 базовыми парами.Запустите извлеченную библиотеку на основе колонки комплект очистки ПЦР, и elute библиотеки в 10 микролитров RNAse свободной воды. Чтобы проверить размер библиотеки, загрузите один микролитер очищенной библиотеки на чип ДНК и следуйте протоколу производителя. Для количественной оценки концентрации библиотеки сначала разбавляют один микролитр очищенной библиотеки в 10-миллимолярном рН-8.0 Tris-Hcl с 0,05%полисорбатом 20 при соотношении 1 к 1000 томов.Затем запустите КККР, используя стандарты ДНК комплекта количественной оценки коммерческой библиотеки. Наконец, пул равное количество библиотек в соответствии с требованиями машины секвенирования и последовательности в системе секвенирования с высокой пропускной способностью. Электроферограмма внеклеточных РНК включала широкий спектр РНК.В отличие от этого, клеточная РНК показала очень отчетливые пики, соответствующие 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA и 28SrRNA. В результате качество обеих библиотек было высоким и сопоставимым. Распределение длины обеих библиотек показало один пик в 22 нуклеотидов, с коррелирует с микроРНК.В отличие от этого, библиотеки из внеклеточных РНК были более неоднородными и содержали еще два пика, которые коррелируют с тРНК, половинками и фрагментами, или пирнами. 65% считывай с клеточной РНК были отображены на микроРНК человека, и на каждую из других малых РНК приходится небольшая часть картографических считывай. В отличие от этого, только 8% внеклеточных РНК соответствовали микроРНК человека.Наиболее распространенной небольшой РНК, к которой читает отображаются были tRNAs, и непревзойденный читает позже соответствует бактериальных последовательностей. Сравнение с геномом крупного рогатого скота показало, что FBS не является источником загрязнения. Таким образом, внеклеточные РНК обладают нетипичным профилем по сравнению с нормальной клеточной РНК.Подготовка библиотеки является важной частью этого протокола. Смешивание должно быть сделано очень осторожно, чтобы избежать пузырьков от формирования. Этот метод также может быть использован для исследования профиля exRNAs из других видов клеток, что помогает изучить функцию exRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Комбинаторные одноклеточных подход к характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность человеческих стволовых и прогениторных населения

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Одноклеточная РНК секвенирование и анализ островков поджелудочной железы человека

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Полный трубопровод для изоляции и секвенирования микроРНК и анализа их с помощью инструментов с открытым исходным кодом

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...