Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Agradecemos al Sr. Claus Bus y Sra. Rita Rosendahl en iNANO su asistencia técnica. Agradecimiento especial a Dr. Daniel Otzen para permitir el uso frecuente de su ultracentrífuga. Este estudio fue apoyado por el fondo de innovación de Dinamarca (proyecto MUSTER).

Nota: Medio de cultivo de células madre mesenquimales (medios de comunicación MSC) se preparó de antemano como se indica en la Tabla de materiales.
1. cultivo celular
Nota: Las células madre mesenquimales humanas puede obtenerse de la médula ósea, tejido adiposo u otras fuentes11. Por otra parte, hMSCs puede comprarse a través de un proveedor. BMSCs utilizados en este protocolo se deriva de la médula ósea de los pacien...

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	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. 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G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018)</li><li>. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1&#8211;48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018)</li><li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. 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Aquí, describimos un protocolo para la siguiente secuencia de generación de exRNAs que permite el análisis de expresión diferencial de las muestras de entrada baja. Adhesión a un protocolo específico para el aislamiento de EV y exRNA es importante porque incluso pequeñas alteraciones (es decir, el paso de ultracentrifugación o un cambio en el tipo de rotor) pueden influir en el transcriptoma y miRNA niveles13,14. Así, independientemente de cómo la exRNA...

Extracelular y circulación RNAs (exRNAs) están presentes en varios fluidos corporales y son resistentes a RNasas1,2. Su alta abundancia, estabilidad y facilidad de accesibilidad son atractivos para la evaluación clínica como marcadores diagnósticos y pronósticos3. El modo de transporte para exRNAs incluyen vesículas extracelulares (EVs), asociación con lipoproteínas (como lipoproteína de alta densidad; HDL) y los complejos de ribonucleoproteína (como con complejos Argonaute2)4.
Un subconjunto de exRNAs son microRNAs (miRNAs), que son pequeños no-codificación RNAs de unos 22 nt que regulan la expresión del gen postranscripcional. Ex-miRNAs se han implicado en la comunicación célula-célula y regulación de la homeostasis de la célula5. Por ejemplo, HDL ofrece ex-miR-223 a las células endoteliales para reprimir la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y de la inflamación6. Curiosamente, miR-223 se ve transportado por vesículas extracelulares de los leucocitos a las células cancerosas de pulmón, programación para tomar a un fenotipo más invasiva de7. Así, el transcriptoma de ex-miRNAs de diversos fluidos corporales y el medio de cultivo celular mejorará grandemente nuestra comprensión de la ex-miRNA señalización.
ARN pequeño de secuencia (seq pequeñas de RNA) es una poderosa herramienta que puede utilizarse para comprender la transcriptómica de RNAs pequeño. No pueden comparar diferentes muestras entre RNAs conocidos diferencialmente expresados sólo novela small RNAs también pueden ser detectados y caracterizados. En consecuencia, es también un método robusto para identificar diferencialmente expresado miRNAs bajo diferentes condiciones. Sin embargo, uno de los obstáculos de pequeño RNA seq es la dificultad en la generación de pequeñas bibliotecas de seq de RNA de bajo exRNA entrada fluidos como líquido cefalorraquídeo, saliva, orina, leche, suero y medios de cultivo. El protocolo de TruSeq pequeños ARN biblioteca Prep de Illumina requiere aproximadamente 1 μg de ARN total de alta calidad y el protocolo de NEBNext ARN pequeño biblioteca Prep Set de New England Biolabs requiere 100 ng-1 μg de RNA8,9. A menudo, ARN total de las muestras están por debajo de límite de detección por espectrofotometría UV-vis convencional.
Ex-miRNAs derivados líquidos corporales son potencialmente buenos marcadores pronósticos y diagnósticos. Sin embargo, con el fin de estudiar los efectos funcionales o para determinar el origen de ex-miRNAs específicos, sistemas de cultivo de células se utilizan en su lugar. Las células madre mesenquimales (MSCs) han sido estudiadas extensivamente porque sus EVs se han implicado en el alivio de muchas enfermedades incluyendo el infarto del miocardio, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad injerto contra huésped10. Aquí, demostramos la purificación de ex-miRNAs de MSCs de médula ósea (BMSCs) y los pasos específicos que se utilizan para optimizar la construcción de biblioteca de pequeños RNA, secuenciación y análisis de datos (figura 1).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

Extracelulares y circulación RNAs (exRNA) son producidos por muchos tipos de células del cuerpo y existen en numerosos fluidos corporales como saliva, plasma, suero, leche y orina. Un subconjunto de estos RNAs son los reguladores postranscripcional, microRNAs (miRNAs). Para delinear los miRNAs producido por tipos celulares específicos, sistemas de cultivo in vitro se pueden utilizar para cosechar y perfil exRNAs deriva de un subconjunto de las células. Los factores secretados de las células madre mesenquimales están implicados en el alivio de numerosas enfermedades y se utiliza como sistema de modelo in vitro. Este documento describe el proceso de recogida, purificación de ARN pequeño y generación de biblioteca a secuencia extracelular miRNAs. ExRNAs de medios de cultivo difieren de ARN celular por ser muestras entradas baja de RNA, que exige procedimientos optimizados. Este protocolo proporciona a una guía completa secuencia de pequeños exRNA de medios de cultivo, mostrando los puntos de control de control de calidad en cada paso durante la secuencia y la purificación de exRNA.

El método descrito en el presente Protocolo está optimizado para recoger exRNA de cultura MSC para la siguiente secuencia de generación. El esquema general del flujo de trabajo está en la figura 1 a la izquierda y los puestos de control respectivos de control de calidad están a la derecha.
La morfología de las células en el día de la colección para indiferenciados (Figu...

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Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Aislamiento, secuenciación y análisis de microRNA extracelular de las células madre mesenquimales humanas

Este protocolo muestra cómo purificar microRNAs extracelulares de medios de cultivo celular para la construcción de biblioteca de RNA pequeño y secuencia de la generación siguiente. Varios puestos de control de calidad se describen para permitir a los lectores a entender qué esperar cuando trabajan con baja entradas muestras como exRNAs.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Este es el primer documento que aborda problemas técnicos en la secuenciación de pequeños ARN derivados de vesículas extracelulares de las células. Las muestras NGS requieren una preparación y un control de calidad estrictos. Debido a la naturaleza de los vehículos eléctricos, el proceso de control de calidad de las muestras EV se desvía de la norma.La ventaja de este protocolo son los pasos de control de calidad para los usuarios por primera vez. Demostrando el procedimiento estará Junyi Su, una asistente de investigación de mi laboratorio. Para empezar, placa células madre mesenquimales humanas a 2.000 células por centímetro cuadrado en medios MSC frescos en cinco matraces T175.Luego crecen las células a 37 grados celsius en un 5% de ambiente de dióxido de carbono y reemplazan los medios cada dos o tres días, hasta que se obtengan cinco matraces del 90% de células confluentes. A continuación, lave las células tres veces con 20 mililitros de PBS por matraz. Agregue 20 mililitros de medios de recogida EV en cada matraz.Y incubarlos a 37 grados centígrados en un 5% de carbono ambiente durante 48 horas. Recoger los medios y centrifugarlo durante 10 minutos a 300 g y cuatro grados Celsius. Luego recoja el sobrenadante, y centrifugar los medios durante 20 minutos a 2.000 g y cuatro grados centígrados.Recoger el sobrenadante de nuevo, y centrifugar los medios durante 30 minutos a 15, 500 g y cuatro grados Celsius. Recoge el sobrenadante por última vez. A continuación, transfiera el medio a tubos de ultracentrífuga.Aquí se utiliza un rotor de ángulo fijo 60Ti, y el pellet se anclará al lado del tubo. Marque el lado de la tapa donde se espera el pellet, y dibuje un círculo en el lado del tubo donde se espera el pellet. Y pele el exRNAs durante 90 minutos a 100,000 g y cuatro grados Celsius.Después de la centrifugación final, retire el sobrenadante. Utilice trozos pequeños de papel absorbente para secar el interior del tubo sin tocar la parte inferior del tubo. Y luego invierta el tubo en un papel absorbente.Para resuspender el pellet, agregue 200 microlitros de PBS en cada tubo y vórtice el tubo durante 30 segundos. Pipetear arriba y abajo 20 veces. A continuación, evalúe las vesículas extracelulares y otras biomoléculas con análisis de seguimiento de nanopartículas.Y almacene el pellet en menos 80 grados Celsius hasta que otros experimentos. Después de descongelar las muestras, utilice un kit de aislamiento de ARN para extraer el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Eluda el ARN de la columna proporcionada en el kit de aislamiento de ARN en 100 microlitros de agua libre de RNAse.Para concentrar el ARN a través de la precipitación de etanol, agregue un microlitro de glucógeno, 10 microlitros de pH de dos molares-5,5 acetato de sodio y 250 microlitros de etanol preenfriado 99% en 100 microlitros del ARN purificado. Luego incubar las muestras a menos-20 grados Celsius durante la noche para precipitar el ARN. Para peletizar el ARN, centrifugar durante 20 minutos a 16.000 g y cuatro grados centígrados.A continuación, retire el sobrenadante y lave el pellet de ARN con un mililitro de 75% de etanol. Centrifugar de nuevo durante cinco minutos a 16.000 g y cuatro grados celsius para peletizar el ARN. Retire el etanol y deje la tapa del tubo de ARN abierta durante cinco a 10 minutos para secar al aire el pellet de ARN.Resuspender el pellet de ARN en siete microlitros de agua libre de RNAse, y utilizar una máquina de electroforesis capilar a base de viruta para detectar la calidad y concentración del ARN. Para comenzar la construcción de la biblioteca, pipetee cinco microlitros del ARN en un tubo PCR pre-enfriado de 0,2 mililitros. A continuación, diluir 3'adaptadores en agua libre de RNAse a una relación de volumen de uno a 10.Agregue 0,5 microlitros del adaptador diluido en el tubo de ARN y pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo ocho veces. Centrifugar brevemente para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo. Incubar la mezcla del adaptador de ARN a 70 grados Centígrados durante dos minutos en un ciclor térmico precalentado.Y luego coloque la muestra de nuevo en el bloque frío. A continuación, agregue un microlitros del tampón de ligadura, 0,5 microlitros de inhibidor de RNAse y 0,5 microlitros de la ligasa de ARN T4 en la mezcla del adaptador de ARN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo ocho veces, y centrifugar brevemente.A continuación, incubar el tubo a 28 grados centígrados durante una hora en el ciclor térmico precalentado. A continuación, añada 0,5 microlitros de la solución de parada en el tubo de muestra, con el tubo permaneciendo en el ciclo térmico. Pipetear hacia arriba y hacia abajo ocho veces, y continuar incubando a 28 grados celsius durante 15 minutos.Diluir 5'adaptadores en agua libre de RNAse a una relación de volumen de uno a 10. Agregue 0,5 microlitros del adaptador diluido en un tubo PCR separado de 0,2 mililitros. Calienta el adaptador de 5' a 70 grados Centígrados durante dos minutos.Y luego coloque la muestra en el bloque refrigerado. Agregue 0,5 microlitros de 10 nanomol ATP y 0,5 microlitros de la ligasse de ARN T4 al tubo de adaptador de 5'. Pipetear arriba y abajo ocho veces.Y centrifugar brevemente para recoger todos los líquidos en la parte inferior. A continuación, añada 1,5 microlitros de la mezcla de 5 adaptadores en la muestra de ARN. Pipetear ocho veces muy suavemente, e incubar la muestra a 28 grados centígrados durante una hora.Para obtener ADNc, diluya la imprimación de transcriptasa inversa en agua libre de RNAse a una relación de volumen de uno a 10. Agregue 0,5 microlitros de la imprimación diluida en la muestra de ARN, pipetear ocho veces muy suavemente y centrifugar brevemente. A continuación, incubar el ARN y la mezcla de imprimación a 70 grados Centígrados durante dos minutos en el ciclor térmico precalentado.Y luego coloque la muestra en un bloque frío. A continuación, agregue un microlitro de 5X First Strand Buffer, 0,5 microlitros de mezcla DNTP de 12,5 mililitros, 0,5 microlitros de TDT de 100 mililolares, 0,5 microlitros de inhibidor de RNAse y 0,5 microlitros de transcriptasa inversa en el tubo de muestra. Pipetear ocho veces muy suavemente.Y centrifugar brevemente. Incubar la muestra a 50 grados centígrados durante una hora en el ciclor térmico precalentado. A continuación, añada 4,25 microlitros de agua ultrapura, 12,5 microlitros de la mezcla de PCR, un microlitro de la imprimación de índice y un microlitro de la imprimación universal en la muestra de ADNcl.Pipetear hacia arriba y hacia abajo ocho veces, y centrifugar brevemente. Por último, coloque la muestra en un ciclor térmico y configure el ciclor de acuerdo con el manuscrito. Para purificar la biblioteca de ARN, utilice un fraccionador de tamaño de ADN automatizado para eluir las bandas entre 140 y 160 pares base.Ejecute la biblioteca extraída en un kit de purificación de PCR basado en columnas y eluda la biblioteca en 10 microlitros de agua libre de RNAse. Para comprobar el tamaño de la biblioteca, cargue un microlitro de la biblioteca purificada en un chip de ADN y siga el protocolo del fabricante. Para cuantificar la concentración de la biblioteca, primero diluya un microlitulador de la biblioteca purificada en pH-8.0 tris-Hcl de 10 mililitros con 0,05% de polisorbato 20 en una relación de volumen de uno a 1.000.A continuación, ejecute QPCR utilizando los estándares de ADN del kit de cuantificación de bibliotecas comerciales. Por último, a la agrupación se agrupan cantidades iguales de las bibliotecas según los requisitos de la máquina de secuenciación y la secuencia en un sistema de secuenciación de alto rendimiento. El electroferograma de ARN extracelulares incluía una amplia gama de ARN.Por el contrario, el ARN celular mostró picos muy distintos, correspondientes a 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA y 28SrRNA. La calidad resultante de ambas bibliotecas fue alta y comparable. La distribución de longitud de ambas bibliotecas mostró un único pico en 22 nucleótidos, con correlaciones con microRNas.Por el contrario, las bibliotecas de ARN extracelulares eran más heterogéneas y contenían dos picos más que se correlacionaban con los ARN, las mitades y los fragmentos, o los piRNAs. El 65% de las lecturas de ARN celular se asignaron a microRNas humanos, y cada uno de los otros ARN pequeños representó una pequeña porción de las lecturas asignadas. En contraste, solo el 8% de los ARN extracelulares coincidieron con los microRN humanos.El ARN pequeño más abundante al que se asignaron las lecturas fueron los ARN, y las lecturas inigualables más tarde coincidían con las secuencias bacterianas. Una comparación con el genoma bovino sugirió que fbS no era una fuente de contaminación. Por lo tanto, los ARN extracelulares presentan un perfil atípico en comparación con el ARN celular normal.La preparación de la biblioteca es una parte crucial de este protocolo. La mezcla debe hacerse muy suavemente para evitar que se formen burbujas. Este método también se puede utilizar para investigar el perfil de exRNAs de otros tipos de células, lo que ayuda a estudiar la función de exRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

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The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Investigación

Genética

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

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Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Secuenciación de ARNm de sangre entera utilizando secuenciación de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Una tubería completa para aislar y secuenciar microRNAs, y analizarlos mediante herramientas de código abierto

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...