Name: isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Onların teknik destek için iNANO Bay Claus otobüs ve Bayan Rita Rosendahl için minnettarız. Onun ultracentrifuge sık sık bizim kullanımına izin veren Dr. Daniel Otzen sayesinde özel. Bu çalışmada yenilik Fonu Danimarka (kabul Projesi) tarafından desteklenmiştir.

Not: Mezenkimal Kök hücre büyüme orta (MSC medya) Malzemeler tablobelirtildiği gibi önceden hazırlanır.
1. hücre kültürü
Not: İnsan Mezenkimal kök hücrelerin kemik iliği, yağ dokusu veya diğer kaynakları11elde edilebilir. Alternatif olarak, hMSCs bir tedarikçi ile satın alınabilir. Bu protokol için kullanılan BMSCs hastaların kemik iliği elde edilen ve bir şirketten satın aldı.
<ol><li>1 x 10<su...

<ol>
	<li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity,+function+and+applications+of+RNA+in+circulation.">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).</li><li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs:+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers.">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184 (2013).</li><li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update.">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances,+challenges,+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology:+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop.">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li><li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+cell-cell+communication+function.">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292 (2014).</li><li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition.">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li><li>. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018)</li><li>. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1&#8211;48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018)</li><li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles.">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li><li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+-+current+trends+and+future+prospective.">Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective.</a> Bioscience Reports. 35 (2), (2015).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Methods+of+Choice+for+Extracellular+Vesicles+(EVs)+Characterization.">The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data.">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li><li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomal-miRNAs+are+critical+factors+for+inducing+anti-proliferation+signalling+to+A2780+and+SKOV-3+ovarian+cancer+cells.">Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 38498 (2016).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Asghar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomonas+sp+is+a+Novel+Cell+Culture+Contaminant.">Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).</li></ol>

Burada, biz fark ifade analizleri düşük giriş örneklerinden sağlar exRNAs, sonraki nesil sıralama için bir iletişim kuralı tanımlamak. Belirli bir iletişim kuralı için EV ve exRNA yalıtım yapıştırma miRNA13,14düzeyde ve hatta küçük değişiklikler (yani, ultrasantrifüj adım ya da bir değişiklik rotor tipi) transcriptome etkileyebilir çünkü önemlidir. Böylece, nasıl exRNA izole ne olursa olsun, bu sonuçları karşılaştırmak iç...

Hücre dışı ve RNA'ların (exRNAs) dolaşan mevcut çeşitli vücut sıvıları ve dirençli doğru RNases1,2. Onların yüksek bereket, istikrar ve rahatlık-in erişilebilirlik tanılama ve prognostik işaretçileri3olarak klinik değerlendirmesi için caziptir. ExRNAs için ulaşım modu dahil hücre dışı veziküller (EVs), (örneğin, yüksek yoğunluklu lipoprotein; lipoproteinler ile dernek HDL) ve Ribonükleoprotein kompleksleri (gibi Argonaute2 kompleksleri ile)4.
ExRNAs bir alt kümesidir yaklaşık 22 kodlamayan RNA'ların, küçük mikroRNA (miRNAs), posttranscriptional gen ekspresyonu düzenleyen nt. Eski miRNAs hücre-hücre iletişim ve hücre homeostazı5Yönetmeliği karıştığı olmuştur. Örneğin, HDL endotel hücre adezyon molekül 1 (ICAM-1) bastırmak için eski-miR-223 sunar ve inflamasyon6. İlginçtir, miR-223 da ekstrasellüler lökosit akciğer kanseri hücreleri, onları bir daha invaziv fenotip7üzerinde almak programlama veziküller tarafından taşınan görülmektedir. Böylece, ex-miRNAs çeşitli vücut sıvıları ve hücre kültür orta transcriptome büyük ölçüde eski miRNA sinyal anlayışımızı geliştirir.
Küçük RNA (küçük RNA seq) sıralama küçük RNA'ların transcriptomics anlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Sadece farklı örnekleri arasında differentially ifade bilinen RNA'ların karşılaştırılabilir ama roman küçük RNA'ların da tespit ve karakterize. Sonuç olarak, farklı koşullar altında differentially ifade miRNAs belirlemek de sağlam bir yöntemdir. Ancak, bir küçük RNA seq engel üzerinden düşük exRNA giriş sıvı serebrospinal sıvı, tükürük, idrar, süt, serum ve kültür medya gibi küçük RNA seq kütüphaneler üreten zor olmasıdır. Illumina TruSeq küçük RNA Kütüphane hazırlık kuralından yaklaşık 1 µg kaliteli toplam RNA'ın gerektirir ve New England Biolabs NEBNext küçük RNA Kütüphane hazırlık ayarla iletişim kuralından 100 ng-1 µg RNA8,9gerektirir. Oftentimes, bu örnekler üzerinden toplam RNA vardır geleneksel UV-VIS Spektrofotometreler için algılama sınırı altında.
EX-miRNAs vücut sıvıları türetilmiş potansiyel olarak iyi prognostik ve tanılama işaretleri vardır. Ancak, fonksiyonel etkilerini incelemek için veya belirli eski miRNAs kökenini belirlemek için hücre kültür sistemleri genellikle bunun yerine kullanılır. Onların EVs miyokard infarktüsü, Alzheimer hastalığı ve Greft versus host hastalığı10dahil olmak üzere birçok hastalığın ortadan kaldırılmasına karıştığı olmuştur çünkü Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Burada, biz eski miRNAs arınma kemik iliği türevi MSCs (BMSCs) ve küçük RNA Kütüphane yapılar, sıralama ve veri analizi (şekil 1) en iyi duruma getirmek için kullanılan belirli adımları göstermektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-012</td>
			<td>Cells used in this protocol was bought from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rotor used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>NC-3000</td>
			<td>Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>35675</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phospho-L-ascorbic&#160;acid trisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752-10G</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#945;,25-Dihydroxyvitamin&#160;D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530-1MG</td>
			<td>Components of the osteogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA and total RNA purification kit for step 4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1514</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kits</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>Library quantification kit used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td>Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippin Prep</td>
			<td>Sage Science</td>
			<td></td>
			<td>Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR purification in step 5.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASTX_Toolkit</td>
			<td>Cold Spring Harbor Lab</td>
			<td></td>
			<td>Trimming low-quality reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cutadapt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adaptor removal in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapping of clean reads in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bedtools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the expression profile in step 6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating, sequencing and analyzing extracellular micrornas from human mesenchymal stem cells

Hücre dışı ve dolaşımdaki RNA'ların (exRNA) birçok hücre türü vücut tarafından üretilen ve tükürük, plazma, serum, süt ve idrar gibi çok sayıda vücut sıvısı bulunmaktadır. Bu RNA'ların bir alt kümesidir posttranscriptional regülatör – mikroRNA (miRNAs). Belirli hücre tipleri tarafından üretilen miRNAs betimlemek için tüp bebek kültür sistemleri hasat için kullanılabilir ve hücre bir alt grubunu profil exRNAs türetilmiş. Mezenkimal Kök hücre salgılanan faktörler çok sayıda hastalıkları ortadan kaldırılmasına karıştığı ve burada tüp bebek modeli sistemi olarak kullanılır. Bu kağıt toplama işlemi, küçük RNA arınma ve Kütüphane üretimi için sıra ekstraselüler miRNAs açıklanır. ExRNAs kültür ortamından hücresel RNA düşük RNA giriş örnekleri, için en iyi duruma getirilmiş yordamları çağıran kalarak farklı. Bu iletişim kuralı her adım kalite kontrol noktalarında exRNA arıtma ve sıralamanın sırasında gösterilen için kapsamlı bir rehber küçük exRNA sıralama kültür ortamından sağlar.

Bu protokol için açıklanan yöntemi sonraki nesil sıralama için MSC kültüründen exRNA toplamak için optimize edilmiştir. İş akışının genel düzeni şekil 1 ' solda ve sağda ilgili kalite kontrol denetim noktaları vardır.
Koleksiyon için gün hücre morfolojisi (şekil 3A) farklılaşmamış ve (şekil 3B) farklı hücrel...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Bu hücrelerden hücre dışı veziküller türetilen küçük RNA'lar sıralama teknik sorunları gideren ilk kağıttır. NGS örnekleri sıkı hazırlık ve kalite kontrol gerektirir. EV'lerin doğası gereği, EV örneklerinin QC işlemi normdan sapır.Bu protokolün avantajı ilk kez kullanıcılar için qc adımları burada. Prosedürü gösteren Junyi Su, benim laboratuvarımdan bir araştırma asistanı olacaktır. Başlamak için, beş T175 şişelerinde taze MSC ortamlarında 2, 000 hücre kare başına insan mezenkimal kök hücreleri plaka.Daha sonra hücreleri %5 karbondioksit ortamında 37 derecede büyütün ve %90 konfluent hücrelerden oluşan beş şişe elde edilene kadar her iki ila üç günde bir ortamı değiştirin. Daha sonra, şişe başına 20 mililitre PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Her şişeye 20 mililitre EV toplama ortamı ekleyin.Ve onları 48 saat boyunca %5 karbondioksit ortamında 37 derecede kuluçkaya yatırın. 300 g ve dört santigrat derece 10 dakika medya toplamak ve santrifüj. Sonra supernatant toplamak ve 20 dakika boyunca medya santrifüj 2, 000 g ve dört derece santigrat.Supernatant tekrar toplamak ve 15, 500 g ve dört derece santigrat 30 dakika boyunca medya santrifüj. Son kez supernatant toplamak. Sonra, ultracentrifuge tüpler için medya aktarın.Burada 60Ti sabit açılı rotor kullanılır ve pelet tüpün yan tarafına sabitlenir. Kapağın peletin beklendiği tarafı işaretleyin ve peletin beklendiği tüpün yan tarafına bir daire çizin. ExRNA'ları 100, 000 g ve 4 santigrat derecede 90 dakika boyunca peletleyin.Son santrifüjden sonra, supernatant çıkarın. Tüpün dibine dokunmadan tüpün içini kurutmak için küçük emici kağıt parçaları kullanın. Sonra da tüpü emici bir kağıda ters çevir.Peleti yeniden askıya almak için, her tüpe 200 mikrolitre PBS ekleyin ve tüpü 30 saniye boyunca girdaplayın. Pipet 20 kez yukarı ve aşağı. Daha sonra nanopartikül izleme analizi ile ekstrasellüler vezikülleri ve diğer biyomolekülleri değerlendirin.Ve peleti daha fazla deneye kadar eksi 80 derecede saklayın. Numuneleri erittikten sonra, üreticinin protokolüne göre RNA ayıklamak için bir RNA izolasyon kiti kullanın. RNA izolasyon kitinde 100 mikrolitre RNae içermeyen su da sağlanan kolondan RNA'yı eleyin.RNA'yı etanol yağışı ile yoğunleştirmek için, saflaştırılmış RNA'nın 100 mikrolitresine bir mikrolitre glikojen, 10 mikrolitre iki molar pH-5,5 sodyum asetat ve 250 mikrolitre önceden soğutulmuş %99 etanol ekleyin. Sonra rna çökeltmek için eksi-20 santigrat derece bir gecede örnekleri kuluçka. RNA'yı 16, 000 g ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj edin.Daha sonra, supernatant çıkarın ve% 75 etanol bir mililitre ile RNA pelet yıkayın. RNA'yı peletlemek için 16, 000 g ve 4 santigrat derecede beş dakika daha santrifüj edin. Etanol çıkarın ve RNA pelet hava kuruması için beş ila 10 dakika boyunca RNA tüp kapağı açık bırakın.RNA peletini yedi mikrolitre RNAiçermeyen suyla yeniden askıya alın ve RNA kalitesini ve konsantrasyonu tespit etmek için çip tabanlı kapiller elektroforez makinesi kullanın. Kütüphane inşaatına başlamak için, pipet, rna beş mikrolitre önceden soğutulmuş 0.2 mililitre PCR tüp içine. Daha sonra, RNAse içermeyen suda 3'adaptörleri bir-10 hacim oranında seyreltin.RNA tüpüne seyreltilmiş adaptörün 0,5 mikrolitresini ekleyin ve karışımı sekiz kez yukarı ve aşağı pipetle. Tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak için kısa bir süre santrifüj edin. RNA adaptör karışımını önceden ısıtılmış bir termal döngüde iki dakika boyunca 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Sonra da numuneyi soğutulmuş bloğun üzerine geri yerleştirin. Daha sonra, rna adaptör karışımı içine ligasyon tampon bir mikrolitre, RNa inhibitörü 0.5 mikrolitre ve T4 RNA ligase 0.5 mikrolitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı sekiz kez, ve santrifüj kısaca.Daha sonra tüpü önceden ısıtılmış termal döngüde bir saat boyunca 28 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, tüp termal döngüiçinde kalan, örnek tüp içine stop çözeltisi 0,5 mikrolitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı sekiz kez, ve 15 dakika boyunca 28 santigrat derecede kuluçkaya devam.RNAse içermeyen suda 5'adaptörleri 1-10 hacim oranında seyreltin. Ayrı bir 0.2 mililitre PCR tüp içine seyreltilmiş adaptör 0,5 mikrolitre ekleyin. Isı 5'adapter 70 santigrat derece iki dakika boyunca santigrat.Sonra da numuneyi soğutulmuş bloğun üzerine yerleştirin. 5'adaptör tüpüne 0,5 mikrolitre 10 nanomol ATP ve 0,5 mikrolitre T4 RNA ligaz ekleyin. Pipet sekiz kez yukarı ve aşağı.Ve kısaca dibe tüm sıvıları toplamak için santrifüj. Daha sonra, RNA örneğine 5'adaptör karışımının 1,5 mikrolitresini ekleyin. Pipet sekiz kat çok nazikçe, ve bir saat boyunca 28 santigrat derece de örnek kuluçka.CDNA elde etmek için, RNAse içermeyen sudaki ters transkriptaz astarını 1-10 hacim oranında seyreltin. RNA örneğine seyreltilmiş astarın 0,5 mikrolitresini, pipetini sekiz kat daha nazik çehre ekleyin ve kısaca santrifüj edin. Daha sonra RNA ve astar karışımını önceden ısıtılmış termal döngüde iki dakika boyunca 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Sonra da numuneyi soğutulmuş bir bloğun üzerine yerleştirin. Daha sonra, örnek tüpüne 5X First Strand Tampon'un bir mikrolitresini, 12,5 milimolar DNTP karışımının 0,5 mikrolitresini, 100 milimolar DTT'nin 0,5 mikrolitresini, 0,5 mikrolitre RNaAse inhibitörü ve 0,5 mikrolitre ters transkriptaz ekleyin. Pipet sekiz kez çok nazikçe.Ve kısaca santrifüj. Numuneyi önceden ısıtılmış termal döngüde bir saat boyunca 50 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, cDNA örneğine 4,25 mikrolitre ultrasaf su, 12,5 pcr karışımı, indeks astarının bir mikrolitresi ve evrensel astarın bir mikrolitresini ekleyin.Pipet yukarı ve aşağı sekiz kez, ve santrifüj kısaca. Son olarak, örneği bir termal döngüye yerleştirin ve çevrimciyi el yazmasına göre ayarlayın. RNA kitaplığını arındırmak için, 140 ile 160 baz çifti arasındaki bantları ayırmak için otomatik dna boyutu fraksiyonu kullanın.Çıkarılan kitaplığı sütun tabanlı PCR arıtma kitiüzerinde çalıştırın ve kütüphaneyi 10 mikrolitre RNaAse içermeyen suyla aşındırın. Kitaplığın boyutunu kontrol etmek için, saflaştırılmış kütüphanenin bir mikrolitresini BIR DNA çipine yükleyin ve üreticinin protokolünü izleyin. Kütüphane konsantrasyonunu ölçmek için, arıtılmış kütüphanenin bir mikrolitresini 10 milimolar pH-8.0 Tris-Hcl'de %0,05 polisorbat 20 ile bire bir hacim oranında seyreltin.Daha sonra ticari kütüphane niceleme kitinin DNA standartlarını kullanarak QPCR çalıştırın. Son olarak, sıralama makinesinin gereksinimlerine göre kitaplıkların eşit miktarda havuz ve yüksek iş yapma lı sıralama sistemi üzerinde sıralanır. Hücre dışı RNA'ların elektroferogramı geniş bir RNA aralığını içeriyordu.Buna karşılık, hücresel RNA 5StRNA, 5SrRNA, 18SrRNA ve 28SrRNA'ya karşılık gelen çok belirgin zirveler gösterdi. Her iki kütüphanenin ortaya çıkan kalitesi yüksek ve karşılaştırılabilir. Her iki kütüphanenin uzunluk dağılımı 22 nükleotitte tek bir tepe gösterdi ve mikroRNA'larla ilişkilidir.Buna karşılık, hücre dışı RNA'lardan gelen kütüphaneler daha heterojendi ve tRNA'lar, yarılar ve parçalar veya piRNA'larla ilişkili iki zirve daha içeriyordu. Hücresel RNA'dan okunan okumaların %65'i insan mikroRNA'larına eşlendi ve diğer küçük RNA'ların her biri haritalanmış okumaların küçük bir kısmını oluşturuyordu. Buna karşılık, hücre dışı RNA'ların sadece %8'i insan mikroRNA'ları ile eşleşti.En bol küçük RNA hangi okur eşlenen tRNA vardı, ve eşsiz okur daha sonra bakteri dizileri ile eşleşti. Büyükbaş genomu ile yapılan bir karşılaştırma, FBS'nin bir kontaminasyon kaynağı olmadığını ileri sürmüştür. Bu nedenle, hücre dışı RNA'lar normal hücresel RNA ile karşılaştırıldığında atipik bir profil sergilerler.Kütüphane hazırlama bu protokolün önemli bir parçasıdır. Karıştırma çok nazikçe kabarcıklar oluşmasını önlemek için yapılmalıdır. Bu yöntem, exRNA'ların işlevini incelemeye yardımcı olan diğer hücre türlerinden exRNA'ların profilini araştırmak için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...