Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

De auteurs wil erkennen van W. Boot voor hulp bij de productie van de steigers. K.E.M. Benders wordt ondersteund door de Alexandre Suerman Stipendium van het universitair medisch centrum. R. Levato en J. Malda worden ondersteund door de Stichting van de artritis (subsidieovereenkomsten CO-14-1-001 en LLP-12, respectievelijk).

Voor dit protocol, is paarden verstikken kraakbeen verkregen uit paarden die was overleden aan andere oorzaken dan artrose. Weefsel werd verkregen met toestemming van de eigenaars, in overeenstemming met de institutionele ethische regels.
Opmerking: Dit protocol beschrijft de fabricage van steigers van decellularized paarden kraakbeen, die kan worden gebruikt voor toepassingen zoals in vitro weefselkweek platforms of voor in vivo inplanting in de regeneratiev...

<ol>
	<li>Dunlop, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+functional+decline+in+older+adults+with+arthritis.">Risk factors for functional decline in older adults with arthritis.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).</li><li>Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+military+perspective+to+articular+cartilage+defects.">A military perspective to articular cartilage defects.</a> The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).</li><li>Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+chondral+defects+in+athletes'+knees:+a+systematic+review.">Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review.</a> Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).</li><li>Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+in+normal+and+osteoarthritis+conditions.">Cartilage in normal and osteoarthritis conditions.</a> Best practice &amp; research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).</li><li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+towards+a+biomaterial-assisted+mesenchymal+stem+cell+therapy.">Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy.</a> Current stem cell research &amp; therapy. 4 (4), 318-329 (2009).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Vashi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+for+Breast+Cancer+Patients+Undergoing+Mastectomy+and+Reconstruction+with+Use+of+DermACELL,+a+Sterile,+Room+Temperature+Acellular+Dermal+Matrix.">Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix.</a> Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).</li><li>Satterwhite, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+wall+reconstruction+with+dual+layer+cross-linked+porcine+dermal+xenograft:+the+&amp;#34;Pork+Sandwich&amp;#34;+herniorraphy.">Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the &amp;#34;Pork Sandwich&amp;#34; herniorraphy.</a> Journal of plastic, reconstructive &amp; aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+recellularization+of+human+tendon+scaffolds+using+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+and+collagen+gel.">Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).</li><li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration.">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li><li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Stromal+Cells+Outperform+Chondrocytes+on+Cartilage-Derived+Matrix+Scaffolds.">Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds.</a> Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).</li><li>Gawlitta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+cartilage-derived+matrix+as+substrate+for+endochondral+bone+regeneration.">Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration.</a> Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+repair+of+cartilage+defects+with+a+novel+acellular+cartilage+matrix+scaffold.">Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li><li>Meyer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+reduces+the+immune+response+to+aortic+valve+allografts+in+the+rat.">Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).</li><li>Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+and+remodeling+outcomes+in+response+to+biologic+scaffolds+with+and+without+a+cellular+component.">Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component.</a> Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).</li><li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response.">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization.">An overview of tissue and whole organ decellularization.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+men+and+elephants:+the+relation+between+articular+cartilage+thickness+and+body+mass.">Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass.</a> PloS One. 8 (2), e57683 (2013).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles.">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li><li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine:+mechanisms+of+in+vivo+remodeling.">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).</li></ol>

De ECM voor articulair kraakbeen is zeer dicht en heel veerkrachtig voor verschillende enzymatische behandelingen. Het multi-step decellularization-protocol in dit artikel beschreven adressen van dergelijke weerstand en met succes genereert decellularized matrices. Om dat te bereiken, omvat het proces over meerdere dagen. Veel decellularization processen zijn voorgesteld voor verschillende soorten weefsels18, en dit artikel beschrijft een protocol geschikt voor de decellularization van kraakbeen. ...

Defecten van de articulaire kraakbeen in de knie veroorzaakt door traumatische gebeurtenissen kunnen leiden tot ongemak, en vooral een grote invloed kunnen hebben op het leven van de jonge en actieve bevolking1,2,3. Bovendien kan kraakbeenletsels op jonge leeftijd leiden tot een snellere begin van artrose verderop in leven4. Momenteel is de enige berging therapie voor veralgemeende artrose van de knie gewrichtsprothese chirurgie. Kraakbeen is een hypocellular, aneuraal en avasculaire weefsel, is haar regeneratief vermogen zeer beperkt. Daarom, regeneratieve geneeskunde benaderingen zijn gewild om te helpen en stimuleren van het regeneratieve vermogen van het oorspronkelijke weefsel. Voor dit doel, worden steigers ontworpen en gebruikt als ofwel een cel-carrier of als een inductieve materiaal dat aanzet differentiatie en regeneratie van weefsels tot door5inheemse cellen van het lichaam.
Decellularized steigers zijn binnen de regeneratieve geneeskunde6algemeen bestudeerd. Het heeft enig succes, bijvoorbeeld in de hulp aan het herstel van de huid7, abdominale structuren8en9van de pezen. Het voordeel van het gebruik van decellularized steigers is hun natuurlijke oorsprong en hun capaciteit voor het behouden van bioactieve signalen die zowel aantrekken en induceren van celdifferentiatie in de juiste geslacht nodig voor weefsel reparatie6,10. Bovendien, aangezien extracellulaire matrix (ECM) een natuurlijke biomaterial is, en decellularization wordt voorkomen een potentiële immuunrespons dat door het verwijderen van cellulaire of genetische inhoud, kwesties met betrekking tot de biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid worden overwonnen.
Kraakbeen afkomstige matrix (CDM) steigers hebben aangetoond grote chondrogenic potentieel in in vitro experimenten wanneer met mesenchymale stromale cellen11agarvoedingsbodem. Bovendien, deze steigers is gebleken de potentie om vorm botweefsel via endochondral ossificatie op ectopische locaties in in vivo instellingen12. CDM steigers begeleiden de vorming van zowel bot en kraakbeen weefsel, deze steigers kunnen houden potentiële voor osteochondraal defect reparatie naast kraakbeen reparatie.
Dit artikel beschrijft een protocol aangepast vanaf Yang et al. (2010),13 voor de productie van decellularized CDM steigers van paarden verstikken kraakbeen. Deze steigers zijn rijk in collageen type II en verstoken van cellen, en bevatten geen elke glycosaminoglycanen (GAGs) na decellularization. Zowel in vitro en in vivo experimenten op (osteo) chondrale gebrek reparatie kunnen plaatsvinden met behulp van deze steigers.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

Osteochondrale gebreken gebrek aan voldoende intrinsieke reparatie capaciteit om te regenereren functioneel gezonde been en kraakbeen weefsel. In zoverre heeft kraakbeen onderzoek gericht op de ontwikkeling van regeneratieve steigers. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van steigers die volledig zijn afgeleid van de extracellulaire matrix natuurlijke kraakbeen, afkomstig uit een paarden donor. Mogelijke toepassingen van de steigers omvatten allografts voor kraakbeen reparatie, bijeenkomen van een steiger voor osteochondraal weefsel engineering en het bieden van in vitro modellen om te bestuderen van de vorming van het weefsel te produceren. Decellularizing van het weefsel, de donor cellen worden verwijderd, maar veel van de natuurlijke bioactieve signalen zijn gedacht te worden bewaard. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dergelijke een natuurlijke steiger in vergelijking met een synthetisch geproduceerde steiger is dat geen verdere functionalization van polymeren nodig om de schijf osteochondraal weefselregeneratie is. De steigers kraakbeen afkomstige matrix kunnen worden gebruikt voor de botten en het kraakbeen weefselregeneratie in zowel in vivo en in vitro-instellingen.

Decellularization van CDM steigers moet altijd worden bevestigd met behulp van histologische technieken, alsmede met behulp van DNA kwantificering te meten van de hoeveelheid DNA-resten. Onvoldoende decellularization kan leiden tot ongewenste immunologische reacties die invloed hebben op de resultaten van in vivo instellingen15,16,17. Voor deze specifieke decellularization methode, DNA was onder ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Decellularized kraakbeen afkomstige steigers kunnen worden gebruikt als een steiger aan gids kraakbeen reparatie en als een middel om te regenereren osteochondraal weefsel. Deze paper beschrijft het proces van de decellularization in detail en biedt suggesties voor deze steigers in in vitro-instellingen.

Fabricage van Decellularized kraakbeen afkomstige Matrix steigers

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Deze methode biedt een manier om steigers afgeleid van inheemse weefsel die kunnen worden gebruikt voor kraakbeen regeneratie te creëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat componenten van inheemse kraakbeen worden bewaard in de steigers die kraakbeenvorming en regeneratie in vitro en in vivo kunnen bevorderen. Hoewel deze methode maakt gebruik van kraakbeen van paarden verstikken gewrichten, kraakbeen uit andere gewrichten kan ook worden gebruikt.Om te beginnen, het verkrijgen van een intacte kadaverische gewricht voor kraakbeen isolatie en verwijder de huid overtollig vet en spierweefsel zoals beschreven in de begeleidende tekst protocol. Definieer vervolgens de locatie waar de voeg articuleert door uitbreidingsbuiging van het gewricht uit te voeren. Maak een horizontale incisie om de gewrichtsholte te bereiken.Maak vervolgens een verticale incisie om het gezamenlijke gebied te openen. De gewrichtsholte is gevuld met synoviale vloeistof die waarschijnlijk zal druppelen uit de holte bij het uitvoeren van de juiste incisie. Blijven openen van het gewricht volledig door het verwijderen van overmatig vet, spieren en pezen, en door het snijden door de pezen die het gewricht bij elkaar te houden.Controleer het kraakbeen zorgvuldig op eventuele macroscopische schade. Als het gewrichtskraakbeen geen glanzender gladde uitstraling heeft of als er bewijs, blaren, kloven of defecten aanwezig zijn, gooi het kraakbeen weg en begin opnieuw. Gebruik een steriele scalpel om het kraakbeen uit het bot te verwijderen.Snijd helemaal naar beneden naar het subchondrale bot om het diepe zone kraakbeen te verwijderen. Verzamel de verwijderde kraakbeenplakjes in 50 milliliter buizen met eerder voorbereide kraakbeenwasoplossing. Druppel tijdens het verwerken regelmatig kraakbeenwasoplossing op het kraakbeen om te voorkomen dat het kraakbeen uitdroogt.Na het verzamelen van het kraakbeen uit alle gebieden van belang, snap bevriezen van het kraakbeen plakjes in vloeibare stikstof gedurende vijf minuten. Breng vervolgens de plakjes kraakbeen over in buizen van 50 milliliter en plaats onmiddellijk de bevroren plakjes in een vriesdroger. Lyophilize de kraakbeen plakjes voor 24 uur met de vriesdroger.Bewaar de gevriesdroogde kraakbeenschijfjes op een droge plaats bij kamertemperatuur. Voor handmatige verwerking, pre chill een mortel en stamper met vloeibare stikstof, plaats dan de lyophilized kraakbeen plakjes in de mortel en dompel ze en vloeibare stikstof. Maal de monsters direct met de hand gedurende ongeveer 45 minuten totdat ze voldoende verpulverd zijn.Als alternatief, om de monsters automatisch te malen met behulp van een freesmachine, beginnen met het voorkoelen van het slijpvak van de freesmachine door toevoeging van vloeibare stikstof. Voeg vervolgens de lyophilized kraakbeenplakjes toe en maal het monster op de vooraf ingestelde snelheid gedurende een paar seconden tot een minuut. Zorg ervoor dat alle deeltjes worden gemalen en dat er geen deeltjes in de bodem van het slijpvak blijven.Tot slot, volg samen met de decellularisatie techniek beschreven in de begeleidende tekst protocol voorafgaand aan de vorming van steigers. Breng de kraakbeendeeltjes met een klein etiket over op een cilindrische kunststof mal. Druk op alle luchtbellen uit om gaatjes in de steiger te voorkomen en vul de mal volledig.Om holtes in de steigers te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat luchtbellen worden geperst tijdens het vullen van de mal met kraakbeendeeltjes. Na de vorming, bevriezen van de mal gedurende 10 minuten bij min 20 graden Celsius. Vervolgens lyophilize het kraakbeen steigers binnen de mal voor 24 uur in een vriesdroger.Verwijder na lyofilie voorzichtig het schavot uit de mal. Plaats de steiger onder een 365 nanometer golflengte UV-licht en kruis link het 's nachts. Vorm steigerschijven door gesteriliseerde steigers in drie millimeter dikke plakjes te snijden.Breng vervolgens de steigers in aparte putten van een zes putplaat. Voeg een milliliter Chondrocyte Expansion Medium toe aan de steigers en laat ze 30 minuten hydrateren. Terwijl de steigers rehydrateren, bereiden de cellen en pipet 50 microliter van de voorbereide cel suspensie op de top van de pre gedrenktste steiger.Dan broeden de steiger voor een uur op 37 graden Celsius. Bij het gebruik van chondrocyten, zorg ervoor dat ze niet zijn uitgebreid voorbij de eerste passage om het aantal van de gedifferentieerde cellen te minimaliseren. Na een uur breng je de plaat terug naar de kweekkap en draai je het schavot voorzichtig om.Pipette de resterende 50 microliters van celopschorting op de steiger en incuberen voor nog een uur op 37 graden Celsius. Voeg na incubatie drie milliliter medium toe aan de putten met steigers. Vermijd pipetten van het medium direct op de steigers en behandel de kweekplaat voorzichtig om loslating van de cellen te voorkomen.Breng de plaat terug naar de couveuse en kweekcel afgestaan steigers bij 37 graden Celsius. Een combinatie van historologische kleuring en DNA kwantificering zijn gebruikt om aan te tonen dat de methoden in dit artikel resulteren in voldoende kraakbeen steigerdecellularisatie. De resulterende steigers bleken geen cellen te bevatten, samen met niet-detecteerbare niveaus van DNA.Ze missen ook glycosaminoglycanen en zijn rijk aan collageen II.Hier wordt neo matrixvorming waargenomen op steigers afgestaan met mesenchymale stamcellen die vier weken lang werden gekweekt. De vorming van glycosaminoglycanen is overvloedig na vier weken. Na het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onderzoeken of decellularisatie succesvol is geweest, alvorens het in om het even welke toepassing te gebruiken.Na deze procedure kan aanvullende biochemische analyse zoals Western blot analyzer worden uitgevoerd om specifieke vragen te beantwoorden over de aanwezigheid van andere componenten zoals groeifactoren. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van weefseltechniek om strategieën voor kraakbeenregeneratie te onderzoeken met behulp van gedecellulariseerd weefsel uit allogene en syngeneïsche bronnen. Voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van een labjas en handschoenen moeten altijd worden genomen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabricage van mechanisch afstembare en bioactieve Metal Steigers voor biomedische toepassingen

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Fabricage en gebruik van droge macroporeuze alginaatsteigers voor virale transductie van T-cellen

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Gelatine Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, en 3D Bioprinting

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...