Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Les auteurs aimerait W. Boot pour aide à la production d’échafaudages. Cintreuses de Kaka est supporté par le Alexandre Suerman Stipendium de l’University Medical Center. Levato R. et J. Malda sont soutenus par la Fondation néerlandaise de l’arthrite (subvention accords CO-14-1-001 et LLP-12, respectivement).

Pour ce protocole, le cartilage de l’articulation fémoro provenait de chevaux morts d’autres causes que l’arthrose. Tissu a été obtenu avec la permission des propriétaires, conformément à la réglementation éthique institutionnelle.
Remarque : Ce protocole décrit la fabrication d’échafaudages de cartilage équin decellularise, qui peut être utilisé pour des applications telles que les plates-formes de culture de tissus in vitro ou in vivo ...

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L’ECM du cartilage articulaire est très dense et très résistant aux différents traitements enzymatiques. Le protocole décellularisation plusieurs étapes décrit dans cet article traite de cette résistance et avec succès génère des matrices decellularise. Pour y parvenir, le processus s’étend sur plusieurs jours. De nombreux processus de décellularisation ont été proposées pour différents types de tissus18, et cet article décrit un protocole adapté à la décellularisation du ...

Défauts de cartilage articulaire au genou causée par des événements traumatisants peuvent conduire à l’inconfort et surtout peuvent avoir un impact important sur la vie de la population jeune et active1,2,3. En outre, les lésions du cartilage à un jeune âge peuvent entraîner une apparition plus rapide de l’arthrose plus tard dans la vie4. Actuellement, la seule thérapie de récupération généralisée d’arthrose du genou est la chirurgie de remplacement de l’articulation. Le cartilage est un hypocellular, aneural et tissu avasculaire, sa capacité de régénération est sévèrement limitée. Par conséquent, des approches de la médecine régénératrice sont recherchées pour aider et stimuler la capacité de régénération du tissu native. À cette fin, les échafaudages sont conçus et utilisés comme soit un porte-cellule ou un matériel inductif qui incite à la différenciation et la régénération des tissus par cellules natives5 du corps.
Échafaudages decellularise ont été largement étudiés au sein de la médecine régénérative,6. Il a eu un certain succès, par exemple, en aidant la régénération de la peau7structures abdominales8et tendons9. L’avantage de l’utilisation des échafaudages decellularise est leur origine naturelle et leur capacité à retenir des indices bioactifs qui attirent et induisent la différenciation cellulaire dans la lignée appropriée requise pour la réparation de tissus6,10. En outre, puisque la matrice extracellulaire (ECM) est un biomatériau naturel et décellularisation empêche une immuno-réaction potentielle en supprimant le contenu cellulaire ou génétique, questions au sujet de la biocompatibilité et la biodégradabilité sont surmontées.
Échafaudages de matrice dérivée du cartilage (MDP) ont montré chondrogéniques grand potentiel dans des expériences in vitro lorsque ensemencée avec des cellules stromales mésenchymateuses11. En outre, ces échafaudages ont montré le potentiel de tissu osseux forme par le biais de l’ossification endochondrale sur emplacements ectopiques dans paramètres in vivo12. Que MDP échafaudages guident la formation des deux os et du tissu cartilagineux, ces échafaudages peuvent tenir potentiels pour la réparation de défauts cartilagineuses en plus de la réparation du cartilage.
Cet article décrit un protocole adapté de Yang et coll. (2010)13 pour la fabrication d’échafaudages de MDP decellularise d’équins étouffer du cartilage. Ces échafaudages sont riches en collagène de type II et dépourvue de cellules et ne contiennent pas des glycosaminoglycanes (GAGs) après décellularisation. Des expériences in vitro et in vivo sur la réparation de défauts chondrales (osteo) peuvent être effectuées à l’aide de ces échafaudages.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

Cartilagineuses défauts n’ont pas une capacité suffisante de réparation intrinsèque pour régénérer fonctionnellement son tissu osseux et du cartilage. Dans cette mesure, recherche de cartilage a mis l’accent sur l’élaboration d’échafaudages régénératrices. Cet article décrit le développement d’échafaudages entièrement dérivées de la matrice extracellulaire du cartilage naturel, provenant d’un donneur équin. Les applications potentielles des échafaudages incluent la production allogreffes pour la réparation du cartilage, agissant comme un échafaudage pour tissu ostéochondral ingénierie et en fournissant des modèles in vitro afin d’étudier la formation des tissus. Par decellularizing le tissu, les cellules du donneur sont supprimés, mais beaucoup d'entre les repères naturels bioactifs sont censés être conservés. L’avantage principal d’utiliser tel un échafaudage naturel par rapport à un échafaudage synthétiquement produit est qu’aucun autre fonctionnalisation des polymères n’est nécessaire à la régénération des tissus cartilagineuses du lecteur. Les échafaudages de matrice dérivée du cartilage peuvent être utilisés pour la régénération des tissus osseux et cartilagineux dans les milieux tant in vivo qu’in vitro.

Décellularisation de MDP échafaudages doit toujours confirmer à l’aide de salissures histologiques ainsi que pour mesurer la quantité de restes d’ADN à l’aide de quantification de l’ADN. Décellularisation insuffisante pourrait conduire à des réactions immunologiques qui influencent les résultats in vivo paramètres15,16,17. Pour cette méthode spécifique décellularisation, ADN ...

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Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Decellularise dérivés de cartilage échafaudages peuvent être utilisés comme un échafaudage pour la réparation du cartilage guide et comme un moyen de régénérer le tissu ostéochondral. Cet article décrit le processus de décellularisation en détail et offre des suggestions pour utiliser ces échafaudages en milieu in vitro.

Fabrication d’échafaudages Decellularise dérivé de Cartilage Matrix

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Cette méthode présente un moyen de créer des échafaudages dérivés de tissus indigènes qui peuvent être utilisés pour la régénération du cartilage. Le principal avantage de cette technique est que les composants du cartilage indigène sont conservés dans les échafaudages qui peuvent favoriser la formation et la régénération du cartilage in vitro et in vivo. Bien que ces méthodes utilisent le cartilage des articulations étouffantes équines, le cartilage de toutes les autres articulations peut être utilisé ainsi.Pour commencer, obtenir une articulation cadavérique intacte pour l’isolement du cartilage et enlever l’excès de graisse de la peau et le tissu musculaire tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, définissez l’endroit où l’articulation s’articule en effectuant l’inflexion d’extension de l’articulation. Faire une incision horizontale pour atteindre la cavité articulaires.Ensuite, faire une incision verticale pour ouvrir la zone articulaires. La cavité articulaires est remplie de liquide synovial qui coulera probablement de la cavité lors de l’exécution de l’incision correcte. Continuez à ouvrir complètement l’articulation en enlevant la graisse excessive, les muscles et les tendons, et en coupant à travers les tendons qui maintiennent l’articulation ensemble.Inspecter soigneusement le cartilage pour déce faire état de dommages macroscopiques. Si le cartilage articulaire n’a pas un aspect lisse plus brillant ou si des preuves, cloques, fissures ou défauts sont présents, jetez le cartilage et recommencez. Utilisez un scalpel stérile pour enlever le cartilage de l’os.Coupez jusqu’à l’os subchondral pour enlever le cartilage de la zone profonde. Recueillir les tranches de cartilage enlevées dans des tubes de 50 millilitres contenant une solution de lavage du cartilage préparée précédemment. Pendant le traitement, goutte à goutte régulière solution de lavage du cartilage sur le cartilage pour empêcher le cartilage de se dessécher.Après avoir recueilli le cartilage de toutes les zones d’intérêt, casser congeler les tranches de cartilage dans l’azote liquide pendant cinq minutes. Transférer ensuite les tranches de cartilage en tubes de 50 millilitres et placer immédiatement les tranches congelées dans un séchoir à congélation. Lyophiliser les tranches de cartilage pendant 24 heures avec le séchoir à congélation.Une fois terminé, conserver les tranches de cartilage lyophilisés dans un endroit sec à température ambiante. Pour le traitement manuel, pré-refroidir un mortier et un pilon avec de l’azote liquide, puis placer les tranches de cartilage lyophilisées dans le mortier et les submerger et l’azote liquide. Moudre directement les échantillons à la main pendant environ 45 minutes jusqu’à ce qu’ils soient suffisamment pulvérisés.Alternativement, pour moudre les échantillons automatiquement à l’aide d’une machine à moudre, commencez par pré-refroidir le compartiment de broyage de la machine à moudre en ajoutant de l’azote liquide. Ajouter ensuite les tranches de cartilage lyophilisées et moudre l’échantillon à sa vitesse prédéfinie pendant quelques secondes jusqu’à une minute. Assurez-vous que toutes les particules sont au sol et qu’aucune particule ne reste au fond du compartiment de broyage.Enfin, suivez la technique de décellularisation décrite dans le protocole texte qui l’accompagne avant de former des échafaudages. Transférer les particules de cartilage avec une petite étiquette dans un moule en plastique cylindrique. Presser toutes les bulles d’air pour éviter les caries dans l’échafaudage et remplir complètement le moule.Pour éviter les caries dans les échafaudages, assurez-vous que les bulles d’air sont pressées tout en remplissant le moule avec des particules de cartilage. Après la formation, congeler le moule pendant 10 minutes à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, lyophiliser les échafaudages de cartilage dans le moule pendant 24 heures dans un séchoir à congélation.Après lyophilisation, retirez soigneusement l’échafaudage du moule. Placez l’échafaud sous une longueur d’onde UV de 365 nanomètres et reliez-le pendant la nuit. Former des disques d’échafaudage en coupant les échafaudages stérilisés en tranches de trois millimètres d’épaisseur.Transférer ensuite les échafaudages dans des puits séparés d’une plaque de six puits. Ajouter un millilitre de milieu d’expansion des chondrocytes sur les échafaudages et leur permettre de se réhydrater pendant 30 minutes. Pendant que les échafaudages se réhydratent, préparer les cellules et pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire préparée sur le dessus de l’échafaudage pré-trempé.Puis incuber l’échafaud pendant une heure à 37 degrés Celsius. Lors de l’utilisation de chondrocytes, assurez-vous qu’ils n’ont pas été élargis après le premier passage afin de minimiser le nombre de cellules différenciées. Après une heure, remettre l’assiette sur le capot de la culture et retourner soigneusement l’échafaudage.Pipette les 50 autres microlitres de suspension cellulaire sur l’échafaudage et incuber pendant une autre heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajouter trois millilitres de milieu aux puits avec des échafaudages. Évitez de passer le milieu directement sur les échafaudages et manipulez doucement la plaque de culture pour éviter le décollement des cellules.Retournez la plaque à l’incubateur et la cellule de culture a cédé des échafaudages à 37 degrés Celsius. Une combinaison de coloration historologique et de quantification d’ADN ont été employées pour montrer que les méthodes présentées dans cet article ont comme conséquence la décellularisation suffisante d’échafaudage de cartilage. Les échafaudages résultants se sont trouvés pour ne contenir aucune cellule avec des niveaux indétectables de l’ADN.Ils manquent également de glycosaminoglycans et sont riches en collagène II.Here, formation de matrice néo est observée sur l’échafaudage cédé avec des cellules souches mésenchymales qui ont été cultivés pendant quatre semaines. La formation de glycosaminoglycans est abondante après quatre semaines. Après avoir tenté cette procédure, il est important d’examiner si la décellularisation a été couronnée de succès, avant de l’utiliser dans n’importe quelle application.Après cette procédure, une analyse biochimique supplémentaire comme l’analyseur de taches occidentales peut être effectuée afin de répondre à des questions spécifiques sur la présence d’autres composants tels que les facteurs de croissance. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire afin d’explorer des stratégies de régénération du cartilage à l’aide de tissus décellulaires provenant de sources allogéniques et syngénéiques. Des précautions comme le port d’un manteau de laboratoire et de gants doivent toujours être prises.

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Génération de cellules de souris Airway épithéliales ESC dérivés Utilisation décellularisé Lung échafauds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabrication et caractérisation des échafaudages de fibre Griffithsin modifiés pour la prévention des Infections sexuellement transmissibles

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Fabrication et utilisation d’échafaudages d’alginate macroporeux secs pour la transduction virale des lymphocytes T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Échafaudages d’hydrogel granulaire méthacryloyl de gélatine : fabrication de microgel à haut débit, lyophilisation, assemblage chimique et bio-impression 3D

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Synthèse d’hydrogels de matrice extracellulaire de cartilage décellularisé

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...