Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Die Autoren möchten W. Boot für Hilfe bei der Herstellung der Gerüste zu bestätigen. K.E.M. Benders stützt sich auf die Alexandre Suerman Stipendium vom University Medical Center. R. Levato und J. Malda werden von der niederländischen Arthritis Foundation unterstützt (Finanzhilfevereinbarungen CO-14-1-001 und LLP-12, beziehungsweise).

Für dieses Protokoll wurde Pferde equine Knie Knorpel entnommen, die aus anderen Ursachen als Arthrose gestorben war. Gewebe wurde mit Erlaubnis der Besitzer, im Einklang mit den institutionellen ethischen Regelungen erhalten.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Gerüsten aus decellularized equine Knorpel, die für Anwendungen wie in Vitro Zellkultur-Plattformen oder in Vivo Implantation in regenerative Medizin Strategien verwendet werde...

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Das ECM des Gelenkknorpels ist sehr dicht und sehr widerstandsfähig gegenüber verschiedenen enzymatischen Behandlungen. In diesem Artikel beschriebenen mehrstufigen Decellularization-Protokoll befasst sich mit solchen Widerstand und erfolgreich erzeugt decellularized Matrizen. Um dies zu erreichen, erstreckt sich der Prozess über mehrere Tage. Viele Decellularization Prozesse sind für verschiedene Arten von Gewebe18vorgeschlagen worden, und dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Dece...

Mängel der Gelenkknorpel im Knie verursacht durch traumatische Ereignisse können zu Unbehagen führen, und vor allem können haben einen großen Einfluss auf das Leben der jungen und aktiven Bevölkerung1,2,3. Darüber hinaus kann Knorpelschäden an einem jungen Alter zu einen schnelleren Wirkungseintritt Arthrose später im Leben4führen. Derzeit ist die einzige Salvage-Therapie für generalisierte Osteoarthritis des Knies Gelenkersatz. Knorpel ist ein Hypocellular, Aneural und avaskuläre Gewebe, ist seine Regenerationsfähigkeit stark eingeschränkt. Regenerative Medizin Ansätze sind daher begehrt zu helfen und die Regenerationsfähigkeit der nativen Gewebe zu stimulieren. Zu diesem Zweck sind Gerüste entwickelt und verwendet als entweder Zellträger oder als eine induktive Material, die stachelt Differenzierung und Regeneration des Gewebes durch den Körper native Zellen5.
Decellularized Gerüste sind weit verbreitet in der regenerativen Medizin6untersucht worden. Es hatte einige Erfolge, beispielsweise bei der Unterstützung der Regeneration der Haut7, Abdominal-Strukturen8und Sehnen9. Der Vorteil der Verwendung decellularized Gerüste ist ihre natürlichen Ursprungs und ihre Fähigkeit, bioaktive Hinweise zu behalten, die sowohl anziehen und Zelldifferenzierung in der entsprechenden Linie für Gewebe-Reparatur-6,-10erforderlich induzieren. Darüber hinaus sind da extrazellulärer Matrix (ECM) eine natürliche Biomaterialien ist und Decellularization eine mögliche Immunantwort verhindert durch Entfernen von zellulären oder genetischen Inhalten, Fragen der Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit überwinden.
Knorpel-abgeleitete Matrix (CDM) Gerüste haben große Chondrogenic im in-vitro-Experimente, wenn mit mesenchymaler Stromazellen Zellen11ausgesät gezeigt. Darüber hinaus haben diese Gerüste das Potenzial, Form Knochengewebe durch Endochondral Verknöcherung auf ektopische Standorte in in-vivo Einstellungen12gezeigt. CDM-Gerüste führt die Bildung von beide Knochen und Knorpelgewebe, diese Gerüste Potenzial für osteochondrale defekt Reparatur neben Knorpelreparatur halten können.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll adaptiert von Yang Et Al. (2010)13 für die Herstellung von decellularized CDM-Gerüste von Equine ersticken Knorpel. Diese Gerüste sind reich an Kollagen Typ II und frei von Zellen und enthalten Glykosaminoglykane (GAGs) nach Decellularization. In vitro und in vivo Experimente an (Osteo) Chondral defekt Reparatur können mit diesen Gerüsten durchgeführt werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

Osteochondrale Defekte fehlen ausreichende intrinsische Reparatur Kapazität, funktionell gesunde Knochen und Knorpel Gewebe zu regenerieren. Insofern hat Knorpel Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung der regenerativen Gerüste. Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung von Gerüsten, die vollständig aus natürlichen Knorpel extrazelluläre Matrix, aus einem equine Spender stammen. Mögliche Anwendungen der Gerüste sind produzieren Allografts für Knorpelreparatur, dienen als Gerüst für osteochondrale Tissue engineering und Bereitstellung von in-vitro-Modellen um Gewebeanordnung zu studieren. Von einem Gewebe, die Spenderzellen werden entfernt, aber viele der natürlichen bioaktiven Cues werden gedacht, um beibehalten werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer natürlichen Gerüst im Vergleich zu einem synthetisch hergestellten Gerüst ist, dass keine weiteren Funktionalisierung von Polymeren Laufwerk osteochondrale Geweberegeneration erforderlich ist. Die Knorpel-abgeleitete Matrix-Gerüste können für Knochen und Knorpel Geweberegeneration in in vivo und in vitro-Einstellungen verwendet werden.

Decellularization CDM Gerüste muss immer bestätigt werden, mit histologischen Färbungen sowie die Verwendung von DNA-Quantifizierung, um die Menge an DNA-Reste zu messen. Unzureichende Decellularization kann zu unerwünschten Immunreaktionen führen, die Einfluss auf die Ergebnisse in in-vivo Einstellungen15,16,17. Für diese spezifische Decellularization-Methode, DNA war unter den Erfassungsb...

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Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Decellularized Knorpel stammenden Gerüste als ein Gerüst, um Führer Knorpelreparatur sowie ein Mittel lässt sich um osteochondrale Gewebe zu regenerieren. Dieses Papier beschreibt den Decellularization Prozess im Detail und enthält Vorschläge, diese Gerüste in in-vitro-Einstellungen zu verwenden.

Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Gerüste aus nativem Gewebe zu erstellen, die für die Knorpelregeneration verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Komponenten des einheimischen Knorpels in den Gerüsten konserviert werden, die die Knorpelbildung und -regeneration in vitro und in vivo fördern können. Obwohl diese Methode Knorpel aus Pferde-Stifle-Gelenke verwendet, Knorpel von allen anderen Gelenken kann auch verwendet werden.Um zu beginnen, erhalten Sie ein intaktes kadaverisches Gelenk für Knorpelisolierung und entfernen Sie die Haut überschüssiges Fett und Muskelgewebe, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als Nächstes definieren Sie die Stelle, an der sich das Gelenk artikuliert, indem Sie eine Verlängerungsbiegung des Gelenks durchführen. Machen Sie einen horizontalen Schnitt, um die Gelenkhöhle zu erreichen.Als nächstes machen Sie einen vertikalen Schnitt, um den Gelenkbereich zu öffnen. Die Gelenkhöhle wird mit Synovialflüssigkeit gefüllt, die wahrscheinlich aus der Höhle tropft, wenn sie einen korrekten Schnitt durchführt. Öffnen Sie das Gelenk weiterhin vollständig, indem Sie übermäßiges Fett, Muskeln und Sehnen entfernen und die Sehnen durchschneiden, die das Gelenk zusammenhalten.Prüfen Sie den Knorpel sorgfältig auf makroskopische Schäden. Wenn der Gelenkknorpel kein glänzenderglattes Aussehen hat oder Wenn Beweise, Blasenbildung, Spalten oder Defekte vorhanden sind, entsorgen Sie den Knorpel und fangen Sie wieder an. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Knorpel aus dem Knochen zu entfernen.Schneiden Sie den ganzen Weg bis zum subchondralen Knochen, um den tiefen Zonenknorpel zu entfernen. Sammeln Sie die entfernten Knorpelscheiben in 50 Milliliter-Rohren mit zuvor vorbereiteter Knorpelwaschlösung. Während der Verarbeitung, regelmäßig tropfen Knorpel Waschlösung auf den Knorpel, um zu verhindern, dass der Knorpel austrocknen.Nachdem Sie den Knorpel aus allen Interessengebieten gesammelt haben, die Knorpelscheiben in flüssigem Stickstoff für fünf Minuten einfrieren. Dann die Knorpelscheiben in 50-Milliliter-Rohre geben und die gefrorenen Scheiben sofort in einen Gefriertrockner geben. Lyophilisieren Sie die Knorpelscheiben 24 Stunden lang mit dem Gefriertrockner.Nach Fertigstellung die gefriergetrockneten Knorpelscheiben an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur aufbewahren. Für die manuelle Verarbeitung einen Mörtel vorkühlen und mit flüssigem Stickstoff bewerfen, dann die lyophilisierten Knorpelscheiben in den Mörtel legen und unterTauchen und flüssigen Stickstoff. Die Proben ca. 45 Minuten direkt von Hand mahlen, bis sie ausreichend pulverisiert sind.Alternativ können Sie die Proben automatisch mit einer Fräsmaschine mahlen, indem Sie zunächst den Schleifraum der Fräsmaschine durch Zugabe von flüssigem Stickstoff vorkühlen. Dann fügen Sie die lyophilisierten Knorpelscheiben und fräsen Sie die Probe mit ihrer voreingestellten Geschwindigkeit für ein paar Sekunden bis zu einer Minute. Stellen Sie sicher, dass alle Partikel geschliffen sind und keine Partikel im Boden des Schleifraums verbleiben.Schließlich folgen Sie zusammen mit der Dezellularisierungstechnik, die im begleitenden Textprotokoll beschrieben ist, bevor Sie Gerüste bilden. Die Knorpelpartikel mit einem kleinen Etikett in eine zylindrische Kunststoffform übertragen. Drücken Sie alle Luftblasen heraus, um Hohlräume im Gerüst zu vermeiden und die Form vollständig zu füllen.Um Hohlräume im Gerüst zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass Luftblasen ausgepresst werden, während die Form mit Knorpelpartikeln gefüllt wird. Nach der Bildung die Form für 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius einfrieren. Dann lyophilisieren Sie die Knorpelgerüste innerhalb der Form für 24 Stunden in einem Gefriertrockner.Nach der Lyophilisierung das Gerüst vorsichtig aus der Form entfernen. Stellen Sie das Gerüst unter eine 365 Nanometer Wellenlänge UV-Licht und kreuzen Sie es über Nacht. Bilden Sie Gerüstscheiben, indem Sie sterilisierte Gerüste in drei Millimeter dicke Scheiben schneiden.Dann die Gerüste in separate Brunnen einer sechs Brunnenplatte übertragen. Fügen Sie einen Milliliter Chondrozyten-Erweiterungsmedium auf das Gerüst und lassen Sie sie für 30 Minuten rehydrieren. Während die Gerüste rehydrieren, bereiten Sie die Zellen und Pipette 50 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension auf dem vorgetränkten Gerüst vor.Dann das Gerüst für eine Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wenn Sie Chondrozyten verwenden, stellen Sie sicher, dass sie nicht über den ersten Durchgang hinaus erweitert wurden, um die Anzahl der differenzierten Zellen zu minimieren. Nach einer Stunde den Teller zur Kulturhaube zurückgeben und das Gerüst vorsichtig umdrehen.Die restlichen 50 Mikroliter Zellsuspension auf dem Gerüst anpfeifen und eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten. Nach der Inkubation drei Milliliter Medium mit Gerüsten in die Brunnen geben. Vermeiden Sie das Pipettieren des Mediums direkt auf das Gerüst und behandeln Sie die Kulturplatte sanft, um eine Ablösung der Zellen zu vermeiden.Bringen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius an den Brutkasten und die Kulturzelle abgetretene Gerüste zurück. Eine Kombination aus historlogischer Färbung und DNA-Quantifizierung wurde verwendet, um zu zeigen, dass die in diesem Artikel vorgestellten Methoden zu einer ausreichenden Knorpelgerüstdezellularisierung führen. Die resultierenden Gerüste enthielten keine Zellen zusammen mit nicht nachweisbaren DNA-Werten.Sie haben auch keine Glykosaminoglykane und sind reich an Kollagen II. Hier wird die Neomatrixbildung auf Gerüsten beobachtet, die mit mesenchymalen Stammzellen abgetreten wurden, die vier Wochen lang kultiviert wurden. Die Bildung von Glykosaminoglykanen ist nach vier Wochen reichlich vorhanden. Nach dem Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu untersuchen, ob die Dezellularisierung erfolgreich war, bevor Sie sie in einer Anwendung verwenden.Nach diesem Verfahren können zusätzliche biochemische Analysen wie Western Blot Analyzer durchgeführt werden, um spezifische Fragen über das Vorhandensein anderer Komponenten wie Wachstumsfaktoren zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gewebetechnik, um Strategien für die Knorpelregeneration mit dezellularisiertem Gewebe aus allogenen und syngenischen Quellen zu erforschen. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Labormantels und Handschuhe sollten immer getroffen werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Forschung

Biotechnik

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Herstellung von mechanisch Tunable und Bioactive Metallgerüste für biomedizinische Anwendungen

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Herstellung und Charakterisierung von Griffithsin-modifizierte Faser Gerüste für die Prävention von sexuell übertragbare Infektionen

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Herstellung und Verwendung von trockenen makroporösen Alginatgerüsten für die virale Transduktion von T-Zellen

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Gelatine-Methacryloyl-Hydrogel-Gerüste: Hochdurchsatz-Mikrogelherstellung, Gefriertrocknung, chemische Assemblierung und 3D-Bioprinting

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Synthese von Hydrogelen aus dezellularisiertem Knorpel mit extrazellulärer Matrix

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...