Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

המחברים רוצה להכיר וו האתחול לקבלת סיוע בתחום הייצור של סיכוי. K.E.M. Benders נתמך על ידי אלכסנדר Suerman Stipendium מן המרכז הרפואי האוניברסיטאי. Levato ר ג'יי Malda נתמכים על ידי קרן דלקת מפרקים הולנדי (מעניקים הסכמים CO-14-1-001 ו- LLP-12, בהתאמה).

עבור פרוטוקול זה, סחוס חנוק הסוסים היה המתקבלים סוסים שמתו מגורמים אחרים מאשר דלקת מפרקים ניוונית. רקמות הושג עם הרשאת הבעלים, בקנה אחד עם תקנות אתיות מוסדיות.
הערה: פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של פיגומים מן הסחוס אקווין decellularized, אשר יכול לשמש עבור יישומים כגון חוץ ?...

<ol>
	<li>Dunlop, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+functional+decline+in+older+adults+with+arthritis.">Risk factors for functional decline in older adults with arthritis.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).</li><li>Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+military+perspective+to+articular+cartilage+defects.">A military perspective to articular cartilage defects.</a> The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).</li><li>Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+chondral+defects+in+athletes'+knees:+a+systematic+review.">Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review.</a> Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).</li><li>Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+in+normal+and+osteoarthritis+conditions.">Cartilage in normal and osteoarthritis conditions.</a> Best practice &amp; research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).</li><li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+towards+a+biomaterial-assisted+mesenchymal+stem+cell+therapy.">Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy.</a> Current stem cell research &amp; therapy. 4 (4), 318-329 (2009).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Vashi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+for+Breast+Cancer+Patients+Undergoing+Mastectomy+and+Reconstruction+with+Use+of+DermACELL,+a+Sterile,+Room+Temperature+Acellular+Dermal+Matrix.">Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix.</a> Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).</li><li>Satterwhite, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+wall+reconstruction+with+dual+layer+cross-linked+porcine+dermal+xenograft:+the+&amp;#34;Pork+Sandwich&amp;#34;+herniorraphy.">Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the &amp;#34;Pork Sandwich&amp;#34; herniorraphy.</a> Journal of plastic, reconstructive &amp; aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+recellularization+of+human+tendon+scaffolds+using+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+and+collagen+gel.">Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).</li><li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration.">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li><li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Stromal+Cells+Outperform+Chondrocytes+on+Cartilage-Derived+Matrix+Scaffolds.">Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds.</a> Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).</li><li>Gawlitta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+cartilage-derived+matrix+as+substrate+for+endochondral+bone+regeneration.">Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration.</a> Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+repair+of+cartilage+defects+with+a+novel+acellular+cartilage+matrix+scaffold.">Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li><li>Meyer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+reduces+the+immune+response+to+aortic+valve+allografts+in+the+rat.">Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).</li><li>Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+and+remodeling+outcomes+in+response+to+biologic+scaffolds+with+and+without+a+cellular+component.">Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component.</a> Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).</li><li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response.">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization.">An overview of tissue and whole organ decellularization.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+men+and+elephants:+the+relation+between+articular+cartilage+thickness+and+body+mass.">Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass.</a> PloS One. 8 (2), e57683 (2013).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles.">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li><li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine:+mechanisms+of+in+vivo+remodeling.">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).</li></ol>

ה-ECM של הסחוס במפרק הוא מאוד צפוף, די גמיש לטיפולים אנזימטיות שונות. פרוטוקול צעד מרובת decellularization המתואר במאמר זה מטפל בכזאת התנגדות ומייצר בהצלחה מטריצות decellularized. כדי להשיג את זה, התהליך משתרע על פני מספר ימים. תהליכים decellularization רבים הוצעו עבור סוגים שונים של רקמות18, מאמר זה מת?...

פגמים הסחוס במפרק הברך נגרמת על ידי אירועים טראומטיים עלול לגרום אי נוחות, ומעל הכל יכולה להיות השפעה גדולה על חייהם של צעירים ובעלי האוכלוסייה1,2,3. יתר על כן, נזק לסחוס בגיל צעיר עלול להוביל התחלה מהירה יותר של דלקת מפרקים ניוונית בהמשך החיים4. כיום, הטיפול ההצלה היחיד עבור כללית דלקת מפרקים ניוונית של הברך הוא ניתוח החלפת מפרק. כמו סחוס hypocellular, aneural, רקמות avascular, יכולת ההתחדשות שלה מוגבל חמור. לכן, רפואה רגנרטיבית גישות רבים מחפשים סיוע ולעורר יכולת ההתחדשות של הרקמה הטבעית. למטרה זו, פיגומים שתוכננו ועברו המשמש כנשא או תא- או כחומר אינדוקטיבית, אשר מסית בידול והתחדשות של רקמת תאים מקורית של הגוף5.
פיגומים decellularized נחקרו באופן נרחב בתוך רפואה רגנרטיבית6. זה היה הצלחה מסוימת, לדוגמה, מסייע לרגנרציה של העור7, מבנים בטן8גידים9. היתרון של שימוש פיגומים decellularized הוא המקור הטבעי שלהם והיכולת שלהם לשמור על רמזים ביואקטיביות זה גם מושך וגם לגרום תאית התמיינות לתוך שושלת היוחסין המתאים הנדרש בשביל לרקמות תיקון6,10. יתר על כן, כיוון מטריצה חוץ-תאית (ECM) הוא biomaterial טבעי, decellularization מונע לתגובה החיסונית פוטנציאליות על-ידי הסרת תוכן סלולרי או גנטי, סוגיות הנוגעות הביו ו biodegradability יש להתגבר.
פיגומים מטריקס הסחוס, נגזר (CDM) הראו chondrogenic נהדר פוטנציאליים ניסויים במבחנה כאשר נזרע עם תאי סטרומה mesenchymal11. בנוסף, פיגומים אלו הראו פוטנציאל טופס רקמת העצם דרך התקשות endochondral על מקומות חוץ רחמי הגדרות ויוו12. כמו CDM פיגומים מדריך היווצרות של שניהם עצם, רקמת סחוס, פיגומים אלו שמשקיעים פוטנציאליות לתיקון פגם osteochondral בנוסף לתקן סחוס.
מאמר זה מתאר פרוטוקול חיבור מקורי יאנג et al. (2010)13 לייצור של פיגומים CDM decellularized של סוסים להחניק את הסחוס. פיגומים אלו הם עשירים ב סוג הקולגן השנייה של תאים, אינם מכילים כל glycosaminoglycans (GAGs) לאחר decellularization. ניסויים במבחנה וגם ויוו על תיקון פגם chondral (osteo) יכול להתבצע באמצעות פיגומים אלו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

פגמים Osteochondral חוסר יכולת תיקון מהותי מספיק להתחדש באופן פונקציונלי קול רקמת עצם, סחוס. במידה זו, סחוס המחקר התמקדה הפיתוח של פיגומים משובי. מאמר זה מתאר את ההתפתחות של פיגומים הנגזרים לחלוטין מטריצה חוץ-תאית טבעיים הסחוס, מגיע תורם הרכיבה. יישומים אפשריים של פיגומים כוללים הפקת allografts לתיקון הסחוס, הגשה לפיגום בשביל לרקמות osteochondral הנדסה ואספקת דגמים במבחנה ללמוד היווצרות רקמה. על ידי decellularizing את הרקמה, תאי התורם מוסרות, אך רבים של המקלות ביו טבעי נחשבים יישמרו. היתרון העיקרי של שימוש לפיגום טבעי לעומת לפיגום לאכסון המיוצר הוא כי אין functionalization נוספת של פולימרים נדרשת התחדשות רקמות osteochondral נסיעה. פיגומים מטריקס הסחוס-derived יכול לשמש עבור התחדשות רקמות עצם, סחוס בהגדרות ויוו והן במבחנה.

תמיד וחייבות להיות מאושרות decellularization של CDM פיגומים באמצעות stainings היסטולוגית, כמו גם באמצעות כימות דנ א כדי למדוד את כמות ה-DNA שרידים. Decellularization לא מספיק עלול להוביל רצויה תגובות חיסוניות להשפיע על תוצאות הגדרות ויוו15,16,17. ע...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

פיגומים הסחוס, נגזר decellularized יכול לשמש בדומה לפיגום כדי לתקן סחוס מדריך וכאמצעי לחדש רקמות osteochondral. מאמר זה מתאר את התהליך decellularization בפירוט ומספק הצעות להשתמש פיגומים אלו בהגדרות במבחנה.

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

שיטה זו מציגה דרך ליצור פיגומים שמקורם ברקמה מקומית אשר ניתן להשתמש בהם להתחדשות הסחוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מרכיבים של הסחוס המקומי נשמרים בפיגומים שיכולים לקדם היווצרות סחוס והתחדשות במבחנה ו in vivo. למרות ששיטה זו משתמשת בסחוס ממפרקי מחניק סוסים, ניתן להשתמש גם בסחוס מכל מפרק אחר.כדי להתחיל, להשיג מפרק גווייה שלם לבידוד סחוס ולהסיר את העור עודף שומן רקמת שריר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הגדר את המיקום שבו המפרק מתבטא על ידי ביצוע פיתול הרחבה של המפרק. בצע חתך אופקי כדי להגיע לחלל המפרקים.לאחר מכן, בצע חתך אנכי כדי לפתוח את אזור המפרקים. חלל המפרקים מלא בנוזל סינוביאלי אשר צפוי לטפטף מהחלל בעת ביצוע חתך נכון. המשך לפתוח את המפרק לחלוטין על ידי הסרת שומן מוגזם, שרירים וגידים, ועל ידי חיתוך דרך הגידים לשמור על המפרק יחד.בדוק בזהירות את הסחוס לכל נזק מקרוסקופי. אם הסחוס המחשוף אין מראה חלק מבריק יותר או אם ראיות, שלפוחיות, שסועים או פגמים קיימים, להשליך את הסחוס ולהתחיל שוב. השתמש אזמל סטרילי כדי להסיר את הסחוס מן העצם.חותכים את כל הדרך עד לעצם subchondral כדי להסיר את הסחוס באזור עמוק. אסוף את פרוסות הסחוס שהוסרו בצינורות 50 מיליליטר המכילים פתרון שטיפת סחוס שהוכן בעבר. בזמן המעובד, מטפטף באופן קבוע תספורת שטיפת סחוס על הסחוס כדי למנוע את הסחוס להתייבש.לאחר איסוף הסחוס מכל תחומי העניין, יש להקפיא את פרוסות הסחוס בחנקן נוזלי למשך חמש דקות. לאחר מכן מעבירים את פרוסות הסחוס לצינורות 50 מיליליטר ומיד הניחו את הפרוסות הקפואות במייבש הקפאה. ליופיליזציה של פרוסות הסחוס למשך 24 שעות עם מייבש ההקפאה.בסיום, יש לאחסן את פרוסות הסחוס המיובשת במקום יבש בטמפרטורת החדר. לעיבוד ידני, יש לצנן מראש מרגמה ועלי עם חנקן נוזלי, ולאחר מכן מניחים את פרוסות הסחוס הליופיליות במכתש ומטביעים אותן וחנקן נוזלי. ישירות לטחון את הדגימות ביד במשך כ 45 דקות עד שהם מרוסקים מספיק.לחלופין, כדי לטחון את הדגימות באופן אוטומטי באמצעות מכונת כרסום, להתחיל על ידי קירור מראש את תא הטחינה של מכונת הטחינה על ידי הוספת חנקן נוזלי. לאחר מכן מוסיפים את פרוסות הסחוס lyophilized וטחנים את המדגם במהירות קבועה מראש שלו במשך כמה שניות עד דקה. ודא כי כל החלקיקים הם הקרקע, כי אין חלקיקים להישאר בחלק התחתון של תא שחיקה.לבסוף, בצע יחד עם טכניקת decellularization המתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה לפני יצירת פיגומים. מעבירים את חלקיקי הסחוס עם תווית קטנה לתבנית פלסטיק גלילית. לחץ על כל בועות האוויר החוצה כדי למנוע חללים בפיגום ולמלא את התבנית לחלוטין.כדי למנוע חללים בפיגומים, ודא כי בועות אוויר לחוצים החוצה תוך מילוי התבנית עם חלקיקי סחוס. לאחר היווצרות, להקפיא את התבנית במשך 10 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ליופילים את פיגומים הסחוס בתוך התבנית במשך 24 שעות במייבש הקפאה.לאחר ליופיליזציה, בזהירות להסיר את הפיגום מן התבנית. מניחים את הפיגום תחת אור UV באורך גל של 365 ננומטר ומצליבים אותו בן לילה. יוצרים דיסקי פיגומים על ידי חיתוך פיגומים מעוקרים לפרוסות בעובי 3 מ"מ.ואז להעביר את הפיגומים לתוך בארות נפרדות של צלחת שש באר. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום הרחבת כונדרוציט על גבי הפיגומים ומאפשרים להם להתייבש במשך 30 דקות. בעוד הפיגומים rehydrate, להכין את התאים ואת פיפטה 50 microliter של ההשעיה התא מוכן על גבי פיגום ספוג מראש.ואז לה הדגירה את הפיגום במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. בעת שימוש בכונדרוציטים, ודא שהם לא הורחבו מעבר למעבר הראשון כדי למזער את מספר התאים המובחנים. לאחר שעה, להחזיר את הצלחת למכסה המנוע התרבותי בזהירות להפוך את הפיגום מעל.פיפטה 50 microliters הנותרים של השעיית תא על הפיגום דגירה במשך שעה נוספת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מוסיפים שלושה מיליליטר של בינוני ל בארות עם פיגומים. הימנע צינורות המדיום ישירות על הפיגומים ולטפל צלחת התרבות בעדינות, כדי למנוע ניתוק של התאים.מחזירים את הצלחת לאנקובטור ולתא התרבות עם פיגומים ב-37 מעלות צלזיוס. שילוב של כתמים היסטוריים וכימות DNA שימשו כדי להראות כי השיטות המוצגות במאמר זה לגרום decellularization פיגום סחוס מספיק. הפיגומים וכתוצאה מכך נמצאו לא מכילים תאים יחד עם רמות בלתי ניתנות לגילוי של DNA.הם גם חסרים glycosaminoglycans והם עשירים קולגן II.Here, היווצרות מטריצה ניאו נצפתה על פיגומים ceded עם תאי גזע mesenchymal כי היו מתורבתים במשך ארבעה שבועות. היווצרות הגליקוזאמינוגליקנים שופעת לאחר ארבעה שבועות. לאחר ניסיון הליך זה, חשוב לבחון אם דפלולריזציה הצליחה, לפני השימוש בו בכל יישום.בעקבות הליך זה, ניתוח ביוכימי נוסף כמו מנתח כתם מערבי יכול להתבצע על מנת לענות על שאלות ספציפיות על נוכחותם של רכיבים אחרים כגון גורמי גדילה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור אסטרטגיות להתחדשות סחוס באמצעות רקמה דפלולרית ממקורות אלוגניים וסינגן. אמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה וכפפות תמיד יש לנקוט.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

המצאה של מכאני מתכוונן ויו מתכת פיגומים עבור יישומים ביו

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

ייצור ואפיון של סיבים Griffithsin-השתנה פיגומים לצורך מניעת מחלות המועברות

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

ייצור ושימוש בפיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים להתמרה נגיפית של תאי T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

פיגומי הידרוג'ל גרגיריים מג'לטין מתקרילויל: ייצור מיקרוג'ל בתפוקה גבוהה, ליופיליזציה, הרכבה כימית והדפסה ביולוגית תלת-ממדית

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

סינתזה של הידרוג'לים מטריצה חוץ-תאית סחוס דה-תאי

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...