Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

Gli autori desidera ringraziare W. Boot per assistenza nella produzione di impalcature. K.E.M. curvatubi è supportato dall'Alexandre Suerman Stipendium da University Medical Center. R. Levato e J. Malda sono supportati dalla olandese Arthritis Foundation (concedere accordi CO-14-1-001 e LLP-12, rispettivamente).

Per questo protocollo, cartilagine ginocchio equina è stata ottenuta da cavalli che erano morto da altre cause di osteoartrite. Tessuto è stato ottenuto con il permesso dei proprietari, in linea con i regolamenti etici istituzionali.
Nota: Questo protocollo descrive la fabbricazione di impalcature da decellularizzati cartilagine equina, che può essere utilizzato per applicazioni come le piattaforme di coltura di tessuti in vitro o in vivo l'impianto nelle ...

<ol>
	<li>Dunlop, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+functional+decline+in+older+adults+with+arthritis.">Risk factors for functional decline in older adults with arthritis.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).</li><li>Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+military+perspective+to+articular+cartilage+defects.">A military perspective to articular cartilage defects.</a> The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).</li><li>Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+chondral+defects+in+athletes'+knees:+a+systematic+review.">Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review.</a> Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).</li><li>Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+in+normal+and+osteoarthritis+conditions.">Cartilage in normal and osteoarthritis conditions.</a> Best practice &amp; research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).</li><li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+towards+a+biomaterial-assisted+mesenchymal+stem+cell+therapy.">Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy.</a> Current stem cell research &amp; therapy. 4 (4), 318-329 (2009).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Vashi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+for+Breast+Cancer+Patients+Undergoing+Mastectomy+and+Reconstruction+with+Use+of+DermACELL,+a+Sterile,+Room+Temperature+Acellular+Dermal+Matrix.">Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix.</a> Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).</li><li>Satterwhite, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+wall+reconstruction+with+dual+layer+cross-linked+porcine+dermal+xenograft:+the+&amp;#34;Pork+Sandwich&amp;#34;+herniorraphy.">Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the &amp;#34;Pork Sandwich&amp;#34; herniorraphy.</a> Journal of plastic, reconstructive &amp; aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+recellularization+of+human+tendon+scaffolds+using+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+and+collagen+gel.">Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).</li><li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration.">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li><li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Stromal+Cells+Outperform+Chondrocytes+on+Cartilage-Derived+Matrix+Scaffolds.">Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds.</a> Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).</li><li>Gawlitta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+cartilage-derived+matrix+as+substrate+for+endochondral+bone+regeneration.">Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration.</a> Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+repair+of+cartilage+defects+with+a+novel+acellular+cartilage+matrix+scaffold.">Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li><li>Meyer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+reduces+the+immune+response+to+aortic+valve+allografts+in+the+rat.">Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).</li><li>Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+and+remodeling+outcomes+in+response+to+biologic+scaffolds+with+and+without+a+cellular+component.">Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component.</a> Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).</li><li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response.">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization.">An overview of tissue and whole organ decellularization.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+men+and+elephants:+the+relation+between+articular+cartilage+thickness+and+body+mass.">Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass.</a> PloS One. 8 (2), e57683 (2013).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles.">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li><li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine:+mechanisms+of+in+vivo+remodeling.">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).</li></ol>

La ECM della cartilagine articolare è molto denso e abbastanza resistente a diversi trattamenti enzimatici. Il protocollo di decellularizzazione multi-passaggio descritto in questo articolo risolve tale resistenza e con successo genera matrici decellularizzate. Per raggiungere questo obiettivo, il processo si estende sopra parecchi giorni. Molti processi di decellularizzazione sono stati proposti per i diversi tipi di tessuti18, e in questo articolo viene descritto un protocollo adatto per decell...

Difetti della cartilagine articolare del ginocchio causato da eventi traumatici possono portare a disagio e soprattutto possono avere un grande impatto sulla vita della popolazione giovane e attiva1,2,3. Inoltre, il danno della cartilagine in giovane età può condurre a una più rapida insorgenza dell'osteoartrite più tardi nella vita4. Attualmente, l'unica terapia di salvataggio per l'osteoartrite generalizzata del ginocchio è la chirurgia di sostituzione dell'articolazione. Come la cartilagine è un tessuto avascolare, aneurali e hypocellular, la sua capacità rigenerativa è severamente limitato. Di conseguenza, gli approcci di medicina rigenerativa sono ricercati per aiutare e stimolare la capacità rigenerativa del tessuto nativo. Per questo scopo, ponteggi sono progettati e utilizzati come sia un cella-elemento portante o come un materiale induttivo che inciti alla differenziazione e rigenerazione del tessuto da cellule native5 del corpo.
Scaffold decellularizzati ampiamente sono stati studiati nell'ambito della medicina rigenerativa6. Ha avuto un certo successo, ad esempio, nel favorire la rigenerazione della pelle7, strutture addominali8e tendini9. Il vantaggio dell'utilizzo di impalcature decellularizzate è loro origine naturale e la loro capacità di trattenere spunti bioattivi che sia ottenere e inducono la differenziazione delle cellule verso la linea appropriata necessaria per la riparazione del tessuto6,10. Inoltre, poiché la matrice extracellulare (ECM) è un biomateriale naturale e decellularizzati impedisce una potenziale risposta immunitaria rimuovendo contenuti cellulari o genetico, sono superare questioni riguardanti la biocompatibilità e biodegradabilità.
Matrice della cartilagine-derivato (CDM) impalcature hanno dimostrato grande condrogenica potenziale negli esperimenti in vitro quando seminati con cellule stromali mesenchimali11. Inoltre, queste impalcature hanno dimostrato il potenziale di tessuto osseo forma attraverso l'ossificazione endochondral sulle posizioni ectopici in impostazioni in vivo12. Come CDM ponteggi guidano la formazione di entrambi dell'osso e tessuto cartilagineo, queste impalcature possono detenere potenziali per riparazione di difetti osteocondrali oltre la riparazione della cartilagine.
Questo articolo viene descritto un protocollo adattato da Yang et al (2010)13 per la produzione di decellularizzazione impalcature CDM da equino soffocare la cartilagine. Queste impalcature sono ricche di collagene di tipo II e privo di cellule e non contengono alcun glicosaminoglicani (gag) dopo decellularizzati. Gli esperimenti sia in vitro che in vivo su riparazione di difetti condrali (osteo) possono essere condotta utilizzando queste impalcature.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

Difetti osteocondrali non hanno sufficiente riparazione intrinseca capacità di rigenerare il tessuto dell'osso e della cartilagine funzionalmente suono. In questa misura, cartilagine ricerca si è concentrata sullo sviluppo di ponteggi rigenerative. Questo articolo viene descritto lo sviluppo di impalcature che completamente sono derivati dalla matrice extracellulare della cartilagine naturale, proveniente da un donatore equino. Potenziali applicazioni di impalcature includono la produzione di allotrapianti per la riparazione della cartilagine, che serve come impalcatura per osteochondral tissue engineering e fornendo modelli in vitro per studiare la formazione di tessuto. Di decellularizing il tessuto, le cellule del donatore vengono rimossi, ma molti dei suggerimenti di bioattivi naturali sono pensati per essere mantenuto. Il vantaggio principale dell'utilizzo di tali un'impalcatura naturale rispetto ad un'impalcatura prodotta sinteticamente è che nessun ulteriore funzionalizzazione di polimeri è necessaria alla rigenerazione tissutale osteocondrali di unità. I ponteggi di matrice della cartilagine-derivato possono essere utilizzati per la rigenerazione di tessuto dell'osso e della cartilagine nelle impostazioni sia in vivo che in vitro.

Decellularizzazione di CDM ponteggi dovrà sempre essere confermati utilizzando stainings istologici, nonché mediante la quantificazione del DNA per misurare la quantità di resti di DNA. Decellularizzazione insufficiente potrebbe portare a risposte immunologiche indesiderate che influenzano i risultati in vivo in impostazioni15,16,17. Per questo metodo di decellularizzazione specifici, DNA era ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Decellularizzati ponteggi cartilagine-derivato possono essere utilizzati come un'impalcatura per la riparazione della cartilagine di guida e come un mezzo per rigenerare il tessuto osteocondrali. Questo articolo descrive dettagliatamente il processo di decellularizzazione e fornisce suggerimenti per utilizzare queste impalcature nelle impostazioni in vitro.

Fabbricazione di scaffold decellularizzati matrice della cartilagine-derivato

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Questo metodo presenta un modo per creare impalcature derivate da tessuto nativo che possono essere utilizzate per la rigenerazione della cartilagine. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i componenti della cartilagine nativa sono conservati nelle impalcature che possono promuovere la formazione e la rigenerazione della cartilagine in vitro e in vivo. Sebbene questo metodo utilizzi cartilagine da giunti soffocanti equini, può essere utilizzata anche cartilagine da qualsiasi altra articolazione.Per iniziare, ottenere un'articolazione cadaverica intatta per l'isolamento della cartilagine e rimuovere il grasso in eccesso della pelle e il tessuto muscolare come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Successivamente, definire la posizione in cui il giunto si articola eseguendo l'inflessione dell'estensione del giunto. Fare un'incisione orizzontale per raggiungere la cavità articolare.Successivamente, fare un'incisione verticale per aprire l'area del giunto. La cavità articolare è riempita con liquido sinoviale che probabilmente gocciola dalla cavità quando si esegue una corretta incisione. Continuare ad aprire completamente l'articolazione rimuovendo grasso eccessivo, muscoli e tendini e tagliando i tendini che tengono insieme l'articolazione.Ispezionare attentamente la cartilagine per eventuali danni macroscopici. Se la cartilagine articolare non ha un aspetto liscio più lucido o se sono presenti prove, vesciche, fenditure o difetti, scartare la cartilagine e ricominciare. Utilizzare un bisturi sterile per rimuovere la cartilagine dall'osso.Tagliare fino all'osso subcondrale per rimuovere la cartilagine della zona profonda. Raccogliere le fette di cartilagine rimosse in tubi da 50 millilitri contenenti soluzione di lavaggio della cartilagine precedentemente preparata. Durante la lavorazione, gocciolare regolarmente la soluzione di lavaggio della cartilagine sulla cartilagine per evitare che la cartilagine si asciughi.Dopo aver raccolto la cartilagine da tutte le aree di interesse, agganciare congelare le fette di cartilagine in azoto liquido per cinque minuti. Quindi trasferire le fette di cartilagine in tubi da 50 millilitri e posizionare immediatamente le fette congelate in un essiccatore. Liofilizzare le fette di cartilagine per 24 ore con l'essiccatore a congelamento.Al termine, conservare le fette di cartilagine liofilizzato in un luogo asciutto a temperatura ambiente. Per la lavorazione manuale, prerischire un mortaio e pestello con azoto liquido, quindi posizionare le fette di cartilagine liofilizzate nella malta e immergerle e azoto liquido. Macinare direttamente i campioni a mano per circa 45 minuti fino a quando non sono sufficientemente polverizzati.In alternativa, per macinare automaticamente i campioni utilizzando una fresatrice, iniziare preraffreddando il vano di rettifica della fresatrice aggiungendo azoto liquido. Quindi aggiungere le fette di cartilagine liofilizzate e fresare il campione alla sua velocità preimpostata per alcuni secondi fino a un minuto. Assicurarsi che tutte le particelle siano macinate e che nessuna particella rimanga nella parte inferiore del compartimento di rettifica.Infine, seguire la tecnica di decellularizzazione descritta nel protocollo di testo di accompagnamento prima di formare impalcature. Trasferire le particelle di cartilagine con una piccola etichetta su uno stampo cilindrico in plastica. Premere tutte le bolle d'aria per evitare cavità nell'impalcatura e riempire completamente lo stampo.Per evitare cavità nelle impalcature, assicurarsi che le bolle d'aria vengano premute durante il riempimento dello stampo con particelle di cartilagine. Dopo la formazione, congelare lo stampo per 10 minuti a meno 20 gradi Celsius. Quindi liofilizzare le impalcature della cartilagine all'interno dello stampo per 24 ore in un essiccatore di congelamento.Dopo la lofilizzazione, rimuovere con cura l'impalcatura dallo stampo. Posizionare l'impalcatura sotto una luce UV a lunghezza d'onda di 365 nanometri e collegarla durante la notte. Formare dischi di impalcature tagliando le impalcature sterilizzate in tre fette spesse millimetri.Quindi trasferire le impalcature in pozzi separatiS di una piastra a sei pozza. Aggiungere un millilitro di Chondrocyte Expansion Medium sopra le impalcature e consentire loro di reidratarsi per 30 minuti. Mentre le impalcature reidratano, preparare le celle e la pipetta 50 microliter della sospensione cellulare preparata sopra l'impalcatura pre imbevuta.Quindi incubare l'impalcatura per un'ora a 37 gradi Celsius. Quando si usano i condrociti, assicurarsi che non siano stati espansi oltre il primo passaggio al fine di ridurre al minimo il numero di cellule differenziate. Dopo un'ora, riportare la piastra sul cappuccio della coltura e capovolta con cura l'impalcatura.Pipettare i restanti 50 microlitri di sospensione cellulare sull'impalcatura e incubare per un'altra ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere tre millilitri di mezzo ai pozzi con impalcature. Evitare di pipeggiare il mezzo direttamente sulle impalcature e maneggiare delicatamente la piastra di coltura per evitare il distacco delle cellule.Riportare la piastra all'incubatore e alla cella di coltura cedette impalcature a 37 gradi Celsius. Una combinazione di colorazione istorica e quantificazione del DNA sono stati utilizzati per dimostrare che i metodi presentati in questo articolo si traducono in una sufficiente decellularizzazione dell'impalcatura della cartilagine. Si è scoperto che le impalcature risultanti non contenevano cellule insieme a livelli non rilevabili di DNA.Mancano anche di glicosaminoglicani e sono ricchi di collagene II.Qui, la formazione di neomatrici si osserva sull'impalcatura ceduta con cellule staminali mesenchimali che sono state coltivate per quattro settimane. La formazione di glicosaminoglicani è abbondante dopo quattro settimane. Dopo aver tentato questa procedura, è importante esaminare se la decellularizzazione ha avuto esito positivo, prima di utilizzarla in qualsiasi applicazione.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori analisi biochimiche come l'analizzatore western blot al fine di rispondere a domande specifiche sulla presenza di altri componenti come i fattori di crescita. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare strategie per la rigenerazione della cartilagine utilizzando tessuti decellularizzati da fonti allogeneiche e sineriche. Devono sempre essere prese precauzioni come indossare un camice da laboratorio e guanti.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Ricerca

Bioingegneria

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabbricazione di meccanicamente Tunable e Bioactive metallo Ponteggi per applicazioni biomediche

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generazione di cellule di topo Airway epiteliali ESC-derivati ​​dall&#39;uso di decellularized Lung Ponteggi

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Fabbricazione e utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco per la trasduzione virale delle cellule T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Scaffold di idrogel granulare di gelatina metacrilico: fabbricazione di microgel ad alta produttività, liofilizzazione, assemblaggio chimico e bioprinting 3D

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Sintesi di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...