Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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著者は、足場の生産について w. ブートを認めたいと思います。K.E.M. ベンダーは大学医療センターからアレクサンドル ・ Suerman Stipendium によってサポートされます。R. Levato、j. マルダはオランダの関節炎財団によってサポートされて (付与契約 CO-14-1-001 と LLP-12、それぞれ)。

このプロトコルでは、変形性関節症以外の原因で死んだ馬から馬抑圧軟骨が得られました。組織制度上の倫理的な規則に沿った、所有者の許可が得られました。
注:このプロトコルでは、脱馬軟骨、再生医療戦略の体内注入、体外培養プラットフォームなどのアプリケーションに使用できるから足場の製作について説明します。酵素処理手順は?...

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関節軟骨の ECM は非常に密、さまざまな酵素治療法にかなり弾力性のあります。この記事で記述されている多段 decellularization プロトコルはそのような抵抗に対処し、脱行列が正常に生成されます。それを達成するには、プロセスは、数日間かけてまたがります。多くの decellularization プロセスが提案されているさまざまな種類の組織の18と軟骨の decellularization に適したプロト...

衝撃的な出来事によって引き起こされる膝の関節軟骨欠損、不快感につながることが、とりわけ若くてアクティブな人口1,2,3の生活に大きな影響を持つことができます。さらに、若い年齢で軟骨の損傷はライフ4で変形性関節症のより急速な発症をもたらすかもしれない。現在、一般化された変形性膝関節に対する唯一のサルベージ療法は関節置換手術です。軟骨は、hypocellular、aneural と無血管組織、その再生能力は厳しく限られるです。したがって、再生医療のアプローチは、ネイティブの組織の再生能力を促し、援助に引っ張りだこに。この目的のため足場が設計され、体のネイティブ セル5携帯会社のいずれか、または分化と組織再生を誘発する誘導物質としてを使用します。
脱足場は、再生医療6内で広く研究されています。それは、皮膚7、腹部の構造8、および腱9の再生支援でたとえば、いくつかの成功を収めています。脱足場を使用の利点は、自然起源および両方を誘致し組織修復6,10に必要な適切な系統に分化を誘導する生理活性の手がかりを保持するための能力です。さらに、細胞外マトリックス (ECM) は自然な生体材料、decellularization は細胞や遺伝子のコンテンツを削除することによって潜在的な免疫応答を防ぐことができますので、生体適合性と生分解性に関する問題は克服されます。
軟骨由来のマトリックス (CDM) 足場 in vitro 実験間葉系間質細胞11シードされるとき潜在的な偉大な軟骨を示しました。さらに、これらの足場は、体内の設定12内の異所性の場所にフォーム骨軟骨内骨化をする可能性を示しています。CDM 足場の形成を導く両方の骨、軟骨、これらの足場が軟骨修復に加えて骨軟骨欠損修復の可能性を持します。
ヤンから適応プロトコルについて説明しますet al. (2010)13の生産馬から脱 CDM 足場のため軟骨を抑えます。これらの足場は II 型コラーゲンと細胞に欠けている裕福な decellularization 後任意のグリコサミノグリカン (Gag) が含まれていません。これらの足場を使用 (骨) 軟骨欠損修復の in vitro および in vivo 実験が行なえます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

膝骨軟骨骨欠損は、機能的サウンドの骨・軟骨の組織を再生する十分な組み込み修復能力を欠いています。この意味において、軟骨研究は、再生の足場の開発に集中しています。この資料では、馬のドナーから来る自然な軟骨の細胞外マトリックスに由来する完全に足場の開発について説明します。足場の潜在的なアプリケーションは、同種骨軟骨組織エンジニア リング、および研究組織を形成する生体外モデルを提供のための足場として、軟骨修復のための生産を含まれます。組織を decellularizing、ドナー細胞が削除されますが、天然の生理活性キューの多くは保持されると考えられています。総合的作り出された足場と比較してこのような自然な足場を使用しての主な利点は、高分子材料のさらなる高機能化がドライブ軟骨組織再生に必要ないことです。軟骨由来の足場は、体内と体外の両方の設定で骨・軟骨の組織再生に使用できます。

CDM 足場の decellularization は、DNA の定量化を使用して DNA の残骸の量を測定すると同様、組織染色を使用してに必ず確認する必要があります。不十分な decellularization は、体内設定15,16,17の結果に影響を与える不要な免疫学的反応につながるかもしれない。この特定の decellularization メソッドの DNA は下?...

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Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

軟骨由来足場の脱は、軟骨組織を再生する手段として、ガイド軟骨修復の足場として使用できます。本稿は decellularization プロセスの詳細について説明します体外の設定でこれらの足場を使用するための提案を提供しています。

脱軟骨由来のマトリックス足場の作製

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

この方法は、軟骨再生に使用できるネイティブ組織に由来する足場を作成する方法を提示する。この技術の主な利点は、ネイティブ軟骨の成分が、インビトロおよびインビボで軟骨形成および再生を促進することができる足場に保存される点である。これらの方法は馬の息苦しい関節からの軟骨を使用するが、他のどの関節からの軟骨も同様に使用することができる。まず、軟骨分離のための無傷のキャダビリック関節を取得し、付随するテキストプロトコルに記載されているように、皮膚過剰な脂肪および筋肉組織を除去する。次に、関節の延長変曲を行って関節が明瞭な位置を定義します。関節腔に到達するために水平切開を行います。次に、関節領域を開くために垂直切開を行います。関節腔は、正しい切開を行う場合に空洞から滴り落ちる可能性が高い滑液で満たされています。過度の脂肪、筋肉、腱を取り除き、関節を一緒に保つ腱を切断することによって、関節を完全に開き続けます。軟骨に大きな損傷がないか慎重に検査してください。関節軟骨が光沢のある滑らかな外観を持っていない場合、または証拠、水疱、裂け目または欠陥が存在する場合は、軟骨を捨てて、再び開始します。骨から軟骨を除去するために無菌メスを使用してください。深いゾーン軟骨を取り除くために軟骨下骨まで切り下ろします。取り出した軟骨スライスを、以前に調製した軟骨洗浄液を含む50ミリリットルのチューブに回収します。加工中、軟骨の洗浄液を軟骨に滴下し、軟骨が乾燥するのを防ぎます。関心のあるすべての領域から軟骨を収集した後、5分間液体窒素で軟骨スライスを凍結スナップします。その後、軟骨スライスを50ミリリットルのチューブに移し、凍結したスライスを凍結乾燥機に入れます。凍結乾燥機で軟骨スライスを24時間凍結乾燥します。終了したら、凍結乾燥軟骨スライスを室温で乾燥した場所に保管します。手動処理の場合は、モルタルと害虫を液体窒素で予め冷やし、凍結乾燥した軟骨スライスをモルタルに入れ、それらを水没させ、液体窒素を水没させます。サンプルを直接手で約45分間粉砕し、十分に粉砕します。あるいは、粉砕機を用いてサンプルを自動的に粉砕し、液体窒素を加えて粉砕機の粉砕室を予め冷却することから始める。その後、凍結乾燥軟骨スライスを追加し、1分間まで数秒間、そのプリセット速度でサンプルを粉砕します。すべてのパーティクルが地面であり、粉砕コンパートメントの底に粒子が残らないようにしてください。最後に、スキャフォールドを形成する前に付随するテキストプロトコルに記載されている脱細胞化技術と共に従ってください。小さなラベルを持つ軟骨粒子を円筒形のプラスチック金型に移します。スキャフォールド内の空洞を避けるためにすべての気泡を押し出し、金型を完全に充填します。足場の空洞を避けるために、軟骨粒子で金型を充填しながら気泡を押し出すことを確認してください。形成後、マイナス20°Cで10分間金型を凍結します。次いで、凍結乾燥機で24時間、カビ内の軟骨足場を凍結乾燥します。凍結乾燥後、慎重にカビから足場を取り除きます。足場を365ナノメートルの波長UV光の下に置き、一晩交差させます。滅菌された足場を3ミリメートルの厚さのスライスに切断することによって足場ディスクを形成する。その後、足場を6つのウェルプレートの別々の井戸に移します。足場の上にコンドロシット拡張培地を1ミリリットル加え、30分間水分補給します。足場が水分補給しながら、あらかじめ浸した足場の上に調製した細胞懸濁液の細胞およびピペット50マイクロリットルを調製する。その後、スキャフォールドを摂氏37度で1時間インキュベートします。軟骨細胞を使用する場合は、分化した細胞の数を最小限に抑えるために、最初の通路を越えて拡張していないことを確認してください。1時間後、プレートを培養フードに戻し、足場を慎重にひっくり返します。残りの50マイクロリットルの細胞懸濁液を足場にピペットし、摂氏37度でさらに1時間インキュベートする。インキュベーションの後、足場でウェルに3ミリリットルの培地を加えます。培地を足場に直接ピペット化することは避け、細胞の剥離を避けるために培養プレートを穏やかに扱ってください。プレートをインキュベーターに戻し、培養細胞はスキャフォールドを摂氏37度で送ります。組織染色とDNA定量の組み合わせが使用され、この記事で提示された方法が十分な軟骨足場脱細胞化をもたらすことを示しています。得られた足場には、検出不可能なレベルのDNAと一緒に細胞が含まれていないことが判明した。彼らはまた、グリコサミノグリカンを欠き、コラーゲンIIが豊富です。ここでは、4週間培養した間葉系幹細胞でセシングされた足場にネオマトリックス形成が観察されます。グリコサミノグリカンの形成は4週間後に豊富です。この手順を試みた後、任意のアプリケーションでそれを使用する前に、脱細胞化が成功したかどうかを調べることが重要です。この手順に従って、ウエスタンブロット分析装置のような追加の生化学的分析を行い、成長因子などの他の成分の存在に関する特定の質問に答えることができます。この技術は、組織工学の分野の研究者が、同種および同系の情報源からの脱細胞化組織を用いた軟骨再生の戦略を探求する道を開いた。ラボコートや手袋を着用するなどの注意事項は必ずお受けください。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

バイオメディカル応用のための機械的に調整可能な生物活性金属スキャフォールドの作製

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

T細胞のウイルス形質導入のための乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドの作製と利用

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3Dバイオプリンティング

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

脱細胞化軟骨細胞外マトリックスハイドロゲルの合成

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...