Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

저자는 건설 기계 생산에 W. 부팅을 인정 하 고 싶습니다. K.E.M. 벤더 대학 의료 센터에서 알렉산더 Suerman Stipendium에 의해 지원 됩니다. R. Levato와 J. Malda 네덜란드 관절염 재단에 의해 지원 됩니다 (부여 계약 공동-14-1-001, LLP-12, 각각).

이 프로토콜에 대 한 말 억압 연골 관절염 보다 다른 원인에서 죽 었다는 말에서 얻은 했다. 조직 기관 윤리 규정에 따라 소유자의 허가 함께 얻은 것입니다.
참고: 이 프로토콜에 체 외 조직 문화 플랫폼 등 응용 프로그램에 대 한 또는 vivo에서 이식 재생 의학 전략에 대 한 사용할 수 있는 decellularized 말 연골에서 장비의 제조를 설명 합니다. 설명 시?...

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization.">An overview of tissue and whole organ decellularization.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+men+and+elephants:+the+relation+between+articular+cartilage+thickness+and+body+mass.">Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass.</a> PloS One. 8 (2), e57683 (2013).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles.">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li><li>Londono, R., Badylak, S. 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관절 연골의 ECM은 매우 조밀 하 고 아주 다른 효소 치료에 탄력. 이 문서에서 설명 하는 여러 단계 decellularization 프로토콜 같은 저항을 해결 하 고 성공적으로 decellularized 행렬을 생성 합니다. 달성 하기 위하여는, 과정은 몇 일 동안 걸쳐. 다른 유형의 조직18, 많은 decellularization 프로세스를 제안 하 고이 문서 연골의 decellularization에 대 한 적합 한 프로토콜을 설명 합니다. 그러나이...

충격적인 사건으로 인 한 무릎 관절 연골 결함, 불편으로 이어질 수 있습니다 그리고 특히 젊고 활동적인 인구1,2,3의 생활에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 젊은 나이에 연골 손상을 인생4나중에 관절염의 더 급속 한 발병 될 수 있습니다. 현재, 무릎의 일반화 된 관절염에 대 한 유일한 구조 치료는 합동 보충 수술입니다. 연골은 hypocellular, aneural, 및 avascular 조직, 재생 능력은 심각 하 게 제한 됩니다. 따라서, 재생 의학 접근은 원조 하 고 네이티브 조직의 재생 능력을 자극 후 모색. 이 목적을 위해 건설 기계 설계 되며 신체의 기본 셀5중 세포 운반대로 또는 차별화와 조직의 재생을 incites 유도 물자로 사용.
Decellularized 건설 기계 재생 의학6내에서 널리 공부 되었습니다. 그것은 했다 약간의 성공을, 예를 들어 피부7,8, 복 부 구조 및 힘 줄9의 재생성을 방 조에. Decellularized 건설 기계를 사용 하 여의 장점은 그들의 자연적인 근원 및 그들의 능력을 모두 유치 하 고 조직 수리6,10에 필요한 적절 한 혈통으로 세포 분화를 유도 하는 생리 활성 신호 유지. 또한, 세포 외 기질 (ECM)은 자연 소재 decellularization 세포 또는 유전자 콘텐츠를 제거 하 여 잠재적인 면역 반응을 방지 하는 때문에, 생체 적합성 및 biodegradability에 관한 문제는 극복 됩니다.
연골에서 파생 된 매트릭스 (CDM) 건설 기계 mesenchymal stromal 세포11시드 때 체 외 실험에서 잠재적인 큰 chondrogenic을 보여왔다. 또한, 이러한 건설 기계 vivo에서 설정12소성 위치에 endochondral 나오고 통해 양식 뼈 조직에 잠재력을 보여왔다. CDM 건설 기계 가이드의 형성 둘 다 뼈 고 연골 조직, 이러한 건설 기계 연골 수리 이외에 osteochondral 결함 수리에 대 한 잠재적인 취소 될 수 있습니다.
이 문서에서는 설명 합니다 양에서 적응 프로토콜 외. (2010)13 말에서 decellularized CDM 장비의 생산에 대 한 억압 연골. 이 건설 기계 콜라겐 유형 II에 셀, 없는 풍부 하 고 decellularization 후 어떤 있다 (개 그)를 포함 하지 않습니다. 이러한 건설 기계를 사용 하 여 (osteo) chondral 결함 수리에 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 수행할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

Osteochondral 결함 기능 소리 뼈와 연골 조직을 재생 하기 충분 한 내장 복구 용량을 부족 합니다. 이 정도로 연골 연구 재생 장비의 개발에 집중 했다. 이 문서는 완전히 말 기증자에서 오는 자연 연골 세포 외 매트릭스에서 파생 된 장비의 개발을 설명 합니다. 장비의 잠재 애플리케이션으로 이식 연골 수리, osteochondral 조직 공학, 생체 외에서 모델 연구 조직 형성을을 제공 하 고 발판으로 봉사에 대 한 생산. Decellularizing 조직, 여 기증자 세포 제거 됩니다, 하지만 많은 천연 생리 활성 신호 유지 될 것으로 생각 되. 종합적으로 생산된 비 계에 비해 자연 비 계를 사용 하 여의 주요 장점은 고분자의 아무 더 기능화 드라이브 osteochondral 조직 재생 하는 데 필요한입니다. 연골에서 파생 된 매트릭스 건설 기계는 vivo에서 그리고 생체 외에서 설정에서 뼈와 연골 조직 재생을 위해 사용할 수 있습니다.

조직학 stainings를 사용 하 여 뿐만 아니라 DNA 잔재의 양을 측정 하 DNA 정량화를 사용 하 여 CDM 장비의 decellularization 항상 확인 되어야 한다. 부족 한 decellularization vivo에서 설정15,,1617결과 영향을 주는 원치 않는 면역학 응답 발생할 수 있습니다. 이 특정 decellularization 메서드에 대 한 DNA 검출 범위 13.6 ± 2.3...

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Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Decellularized 연골 파생 된 건설 기계 osteochondral 조직을 재생 하 가이드 연골 수리를 발판으로 및 수단으로 사용할 수 있습니다. 이 종이 decellularization 프로세스를 자세히 설명 하 고 생체 외에서 설정에서 이러한 건설 기계를 사용 하 여 제공 합니다.

Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

이 방법은 연골 재생에 사용될 수 있는 네이티브 조직에서 파생된 스캐폴드를 만드는 방법을 제시한다. 이 기술의 주요 장점은 기본 연골의 구성 요소가 시험관 내 및 생체 내에서 연골 형성 및 재생을 촉진 할 수있는 스캐폴드에 보존된다는 것입니다. 이러한 방법은 말의 연골을 사용하여 관절을 억누르지만 다른 관절의 연골도 사용할 수 있습니다.시작하려면, 연골 격리를 위한 손상되지 않은 카다브릭 관절을 얻고 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 피부 과잉 지방 및 근육 조직을 제거한다. 다음으로, 조인트의 확장 변곡점을 수행하여 관절이 관절이 명료하는 위치를 정의한다. 조인트 캐비티에 도달하기 위해 수평 절개를 합니다.다음으로, 관절 영역을 열어 수직 절개를합니다. 관절 구멍은 올바른 절개를 수행 할 때 공동에서 떨어지는 가능성이 활액으로 채워집니다. 과도한 지방, 근육 및 힘줄을 제거하고 관절을 함께 유지하는 힘줄을 절단하여 관절을 완전히 열어 보십시오.연골을 주의 깊게 검사하여 거시적 손상이 있는지 검사합니다. 관절 연골이 광택이 매끄러운 외관을 가지고 있지 않거나 증거, 물집, 갈라진 또는 결함이 있는 경우 연골을 버리고 다시 시작합니다. 멸균 메스를 사용하여 뼈에서 연골을 제거하십시오.깊은 영역 연골을 제거하기 위해 아전드랄 뼈까지 모든 방법을 잘라. 이전에 준비된 연골 세척 용액을 포함하는 50 밀리리터 튜브에서 제거된 연골 조각을 수집합니다. 가공 하는 동안, 정기적으로 연골에 연골 세척 용액을 드립 연골 건조에서 연골을 방지 합니다.관심있는 모든 영역에서 연골을 수집 한 후, 5 분 동안 액체 질소에 연골 조각을 동결 스냅. 그런 다음 연골 조각을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 냉동 된 조각을 동결 건조기에 즉시 놓습니다. 동결 건조기와 함께 24 시간 동안 연골 조각을 lyophilize합니다.완료되면, 실온에서 건조 한 장소에 동결 말린 연골 조각을 저장합니다. 수동 처리를 위해 박격포를 미리 식히고 액체 질소로 유봉한 다음 lyophilized 연골 조각을 박격포에 넣고 침수하고 액체 질소를 담급니다. 샘플을 충분히 분쇄 할 때까지 약 45 분 동안 손으로 직접 분쇄합니다.또는 밀링 기계를 사용하여 자동으로 샘플을 분쇄하려면 액체 질소를 추가하여 밀링 기계의 연삭 구획을 미리 냉각하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 lyophilized 연골 조각을 추가하고 최대 1 분 동안 몇 초 동안 미리 설정된 속도로 샘플을 밀링합니다. 모든 파티클이 접지되고 파티클이 연삭 구획의 맨 아래에 남아 있지 않도록 하십시오.마지막으로, 스캐폴드를 형성하기 전에 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 탈세포화 기법과 함께 따르십시오. 작은 라벨이 있는 연골 입자를 원통형 플라스틱 금형으로 옮기습니다. 모든 기포를 눌러 비계의 구멍을 피하고 금형을 완전히 채웁니다.스캐폴드S의 충치를 피하려면 금형을 연골 입자로 채우는 동안 기포를 압착해야 합니다. 형성 후 영하 20도에서 10 분 동안 금형을 동결하십시오. 그런 다음 동결 건조기에서 24 시간 동안 금형 내의 연골 비계를 lyophilize합니다.lyophilization 후, 조심스럽게 금형에서 비계를 제거합니다. 365 나노미터 파장 UV 빛 아래에 스캐폴드를 놓고 하룻밤 사이에 교차 연결합니다. 멸균 된 비계를 3 밀리미터 두께의 조각으로 절단하여 스캐폴드 디스크를 형성합니다.그런 다음 비계를 6 개의 우물 판의 별도의 우물로 옮기. 스캐폴드 위에 1밀리리터의 콘드로사이클 확장 매체를 추가하고 30분 동안 수분을 보충할 수 있습니다. 비계가 재수화되는 동안, 미리 담근 비계 위에 준비된 세포 현탁액의 세포 및 파이펫 50 마이크로리터를 준비한다.그런 다음 37 °C에서 1 시간 동안 비계를 배양하십시오. 연골세포를 사용할 때, 분화된 세포의 수를 최소화하기 위해 첫 번째 통로를 지나 확장되지 않았는지 확인하십시오. 1 시간 후, 문화 후드에 접시를 반환하고 조심스럽게 비계를 뒤집어.스캐폴드에 남은 50마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫하고 섭씨 37도에서 또 다른 시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 비계로 우물에 3 밀리리터의 매체를 추가합니다. 비계에 직접 배지를 파이프하지 말고 세포의 분리를 피하기 위해 배양 판을 부드럽게 처리하십시오.플레이트를 인큐베이터와 배양 세포에 섭씨 37도에서 양보한 비계에 반품한다. 조직학적 염색과 DNA 정량화의 조합은 이 문서에서 제시된 방법이 충분한 연골 비계 탈세포화를 초래한다는 것을 보여주기 위해 사용되었습니다. 결과 발판은 DNA의 탐지할 수 없는 수준과 더불어 어떤 세포도 포함하는 것을 찾아냈습니다.그(것)들은 또한 글리코아미노글리칸이 부족하고 콜라겐 II.Here가 풍부합니다, 네오 매트릭스 형성은 4 주 동안 배양된 중간엽 줄기 세포로 양보된 비계에서 관찰됩니다. 글리코아미노글리칸의 형성은 4주 후에 풍부합니다. 이 절차를 시도한 후 모든 응용 프로그램에서 사용하기 전에 탈세포화가 성공했는지 여부를 검사하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 서양 블롯 분석기 와 같은 추가 생화확적인 분석은 성장 인자와 같은 그밖 분대의 존재에 관하여 특정 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다. 이 기술은 조직 공학 분야의 연구원들이 동종 및 합성 소스에서 탈세포 조직을 사용하여 연골 재생 전략을 탐구하는 길을 열었습니다. 실험실 코트와 장갑착용 등의 예방 조치는 항상 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

연구

생체공학

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Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

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Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

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Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

젤라틴 메타크릴로일 과립형 하이드로겔 스캐폴드: 고처리량 마이크로겔 제조, 동결건조, 화학 조립 및 3D 바이오프린팅

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 합성

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...