Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Los autores desean reconocer arranque W. asistencia en la producción de los andamios. K.E.M. dobladores es apoyado por el Alexandre Suerman Stipendium de la University Medical Center. Levato R. y J. Malda son apoyados por la fundación holandesa de artritis (conceder acuerdos CO-14-1-001 y LLP-12, respectivamente).

Este protocolo, se obtuvo cartílago equino Babilla de caballos que habían muerto de otras causas de artrosis. Tejido se obtuvo con el permiso de los propietarios, conforme a las normas éticas institucionales.
Nota: Este protocolo describe la fabricación de andamios de decellularized cartílago equino, que puede utilizarse para aplicaciones tales como plataformas de cultivo de tejidos in vitro o en vivo la implantación de estrategias de la medicina regene...

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+reduces+the+immune+response+to+aortic+valve+allografts+in+the+rat.">Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).</li><li>Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+and+remodeling+outcomes+in+response+to+biologic+scaffolds+with+and+without+a+cellular+component.">Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component.</a> Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).</li><li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response.">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization.">An overview of tissue and whole organ decellularization.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+men+and+elephants:+the+relation+between+articular+cartilage+thickness+and+body+mass.">Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass.</a> PloS One. 8 (2), e57683 (2013).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles.">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li><li>Londono, R., Badylak, S. 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El ECM del cartílago articular es muy densa y bastante resistente a diversos tratamientos enzimáticos. El protocolo de la descelularización de varios pasos descrito en este artículo aborda de esa resistencia y con éxito genera matrices decellularized. Para ello, el proceso se extiende durante varios días. Muchos procesos de descelularización han sido propuestos para los diferentes tipos de tejidos18, y este artículo describe un protocolo adecuado para la descelularización de cartílago. E...

Defectos del cartílago articular de la rodilla causada por eventos traumáticos pueden conducir a molestias y sobre todo pueden tener un gran impacto en la vida de la población joven y activa1,2,3. Por otra parte, daño del cartílago en una edad joven puede llevar a un inicio más rápido de la osteoartritis más adelante en vida4. Actualmente, la única terapia de salvamento para la osteoartritis generalizada de la rodilla es la cirugía de reemplazo articular. Como el cartílago es un tejido avascular, hipocelulares y aneural, su capacidad de regeneración está severamente limitada. Por lo tanto, enfoques de la medicina regenerativa son buscados para ayudar y estimular la capacidad regenerativa del tejido nativo. Para ello, los andamios están diseñados y utilizados como un celular-portador o como un material inductivo que incita a la diferenciación y regeneración de los tejidos del cuerpo las células nativas5.
Decellularized andamios han sido estudiados ampliamente en la medicina regenerativa6. Ha tenido cierto éxito, por ejemplo, ayudar en la regeneración de la piel7, estructuras abdominales8y tendones9. La ventaja de utilizar andamios decellularized es su origen natural y su capacidad para retener señales bioactivos que tanto atraen e inducen la diferenciación celular en el linaje apropiado requerido para la reparación de tejido6,10. Por otra parte, como matriz extracelular (ECM) es un biomaterial natural y descelularización previene una posible respuesta inmune mediante la eliminación de contenido celular o genético, se superan problemas con respecto a la biocompatibilidad y biodegradabilidad.
Derivados de cartílago matriz (MDL) andamios han demostrado gran condrogénica posibles en experimentos in vitro cuando sembrado con células estromales mesenquimales11. Además, estos andamios han demostrado el potencial de tejido óseo de forma a través de la osificación endocondral en localizaciones ectópicas en configuración en vivo12. Como MDL andamios guían la formación de ambos huesos y tejido cartilaginoso, estos andamios pueden tener potenciales para la reparación de defectos osteocondrales además de reparación de cartílago.
Este artículo describe un protocolo adaptado de Yang et al (2010)13 para la producción de andamios decellularized de CDM de equinos sofocar cartílago. Estos andamios son ricos en colágeno de tipo II y desprovisto de células y no contienen ningún glicosaminoglicanos (GAGs) después de descelularización. Experimentos in vitro e in vivo sobre la reparación del defecto condral (osteo) pueden realizarse con estos andamios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

Los defectos osteocondrales carecen de suficiente capacidad de reparación intrínseca a regenerar el tejido óseo y cartílago funcionalmente sano. En este sentido, investigación de cartílago se ha centrado en el desarrollo de andamios regenerativos. Este artículo describe el desarrollo de andamios completamente derivadas de la matriz extracelular del cartílago natural, procedente de un donante de equino. Posibles aplicaciones de las matrices de soporte incluyen producción de aloinjertos para reparación de cartílago, que sirve como un andamio para tejido osteocondral ingeniería y proporcionando modelos in vitro para estudiar la formación del tejido. Por decellularizing el tejido, las células del donante se retiran, pero muchas de las señales naturales bioactivas se piensan para ser retenido. La principal ventaja de utilizar un andamio tan natural en comparación con un andamio sintético producido es que ninguna otra funcionalización de polímeros se requiere para regeneración de tejido osteocondral en coche. Los andamios derivados de cartílago matriz pueden utilizarse para la regeneración de tejido óseo y cartílago en entornos tanto in vivo como in vitro.

Descelularización de MDL andamios siempre debe ser confirmada usando los stainings histológicos, así como uso de cuantificación de ADN para medir la cantidad de restos de ADN. Descelularización insuficiente puede llevar a respuestas inmunológicas no deseadas que influyen en los resultados en entornos en vivo15,16,17. Para este método específico descelularización, ADN fue por debajo del r...

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Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Decellularized andamios derivados de cartílago pueden utilizarse como un andamio para reparación de cartílago de guía y como medio para regenerar tejido osteocondral. Este documento describe el proceso de descelularización en detalle y ofrece sugerencias para utilizar estos andamios en configuración in vitro.

Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Este método presenta una manera de crear andamios derivados del tejido nativo que se puede utilizar para la regeneración del cartílago. La principal ventaja de esta técnica es que los componentes del cartílago nativo se conservan en los andamios que pueden promover la formación y regeneración del cartílago in vitro e in vivo. Aunque este método utiliza cartílago de las articulaciones de la asfixia equina, el cartílago de cualquier otra articulación se puede utilizar también.Para comenzar, obtener una articulación cadavérica intacta para el aislamiento del cartílago y eliminar el exceso de grasa de la piel y el tejido muscular como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña. A continuación, defina la ubicación donde se articula la articulación realizando la inflexión de extensión de la articulación. Haga una incisión horizontal para llegar a la cavidad articular.A continuación, haga una incisión vertical para abrir el área de la articulación. La cavidad articular está llena de líquido sinovial que probablemente gotea de la cavidad al realizar la incisión correcta. Continúe abriendo la articulación por completo mediante la eliminación de grasa excesiva, músculos y tendones, y cortando a través de los tendones que mantienen la articulación unida.Inspeccione cuidadosamente el cartílago en busca de cualquier daño macroscópico. Si el cartílago articular no tiene un aspecto liso más brillante o si hay evidencia, ampollas, hendiduras o defectos, deseche el cartílago y comience de nuevo. Usa un bisturí estéril para extraer el cartílago del hueso.Corte todo el camino hasta el hueso subcondral para eliminar el cartílago de la zona profunda. Recoger las rodajas de cartílago retiradas en tubos de 50 mililitros que contienen solución de lavado de cartílago previamente preparada. Mientras se procesa, gotee regularmente la solución de lavado de cartílago en el cartílago para evitar que el cartílago se seque.Después de recoger el cartílago de todas las áreas de interés, congela las rodajas de cartílago en nitrógeno líquido durante cinco minutos. Luego transfiera las rodajas de cartílago en tubos de 50 mililitros e inmediatamente coloque las rodajas congeladas en un secador de congelación. Liofilizar las rodajas de cartílago durante 24 horas con el secador de congelación.Cuando haya terminado, guarde las rodajas de cartílago liofilización en un lugar seco a temperatura ambiente. Para el procesamiento manual, precalar un mortero y peste con nitrógeno líquido, luego coloque las rodajas de cartílago liofilizado en el mortero y sumerjalas y nitrógeno líquido. Moler directamente las muestras a mano durante aproximadamente 45 minutos hasta que estén suficientemente pulverizadas.Alternativamente, para moler las muestras automáticamente utilizando una fresadora, comience por preenfriar el compartimiento de molienda de la fresadora mediante la adición de nitrógeno líquido. A continuación, agregue las rodajas de cartílago liofilizado y mida la muestra a su velocidad preestablecida durante unos segundos hasta un minuto. Asegúrese de que todas las partículas estén molidas y de que no haya partículas en la parte inferior del compartimiento de molienda.Por último, siga la técnica de descelularización descrita en el protocolo de texto adjunto antes de formar andamios. Transfiera las partículas de cartílago con una pequeña etiqueta a un molde de plástico cilíndrico. Presione todas las burbujas de aire hacia fuera para evitar las cavidades en el andamio y llenar el molde por completo.Para evitar caries en los andamios, asegúrese de que las burbujas de aire se presionan hacia fuera mientras llena el molde con partículas de cartílago. Después de la formación, congelar el molde durante 10 minutos a menos 20 grados Centígrados. Luego liofilizar los andamios de cartílago dentro del molde durante 24 horas en un secador de congelación.Después de la liofilización, retire cuidadosamente el andamio del molde. Coloque el andamio debajo de una luz UV de longitud de onda de 365 nanómetros y úntelo durante la noche. Forme discos de andamios cortando andamios esterilizados en rodajas de tres milímetros de espesor.A continuación, transfiera los andamios a pozos separados de una placa de seis pozos. Añadir un mililitro de Chondrocyte Expansion Medium en la parte superior de los andamios y dejar que se rehidraten durante 30 minutos. Mientras los andamios se rehidratan, prepare las células y la pipeta 50 microlitros de la suspensión celular preparada en la parte superior del andamio pre remojo.Luego incuba el andamio durante una hora a 37 grados Centígrados. Cuando utilice condrocitos, asegúrese de que no se han expandido más allá del primer pasaje para minimizar el número de células diferenciadas. Después de una hora, devuelva la placa a la campana de cultivo y gire cuidadosamente el andamio.Pipetear los 50 microlitros restantes de suspensión celular en el andamio e incubar durante otra hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, añadir tres mililitros de medio a los pocósitos con andamios. Evite pipetear el medio directamente sobre los andamios y manipule la placa de cultivo suavemente para evitar el desprendimiento de las células.Devuelva la placa a la incubadora y a los andamios cedidos de células de cultivo a 37 grados centígrados. Se ha utilizado una combinación de tinción historlógica y cuantificación del ADN para demostrar que los métodos presentados en este artículo dan como resultado una descelularización suficiente del andamio del cartílago. Se encontró que los andamios resultantes no contenían células junto con niveles indetectables de ADN.También carecen de glicosaminoglicanos y son ricos en colágeno II.Aquí, la formación de neo matriz se observa en el andamio cedido con células madre mesenquimales que se cultivaron durante cuatro semanas. La formación de glicosaminoglicanos es abundante después de cuatro semanas. Después de intentar este procedimiento, es importante examinar si la descelularización se ha realizado correctamente, antes de usarla en cualquier aplicación.Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis bioquímico adicional como el analizador de manchas occidentales para responder preguntas específicas sobre la presencia de otros componentes como factores de crecimiento. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran estrategias para la regeneración del cartílago utilizando tejido descelularizado de fuentes alogénicas y singéneas. Siempre se deben tomar precauciones como el uso de una bata de laboratorio y guantes.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

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Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Andamios de hidrogel granular de metacriloilo de gelatina: fabricación de microgel de alto rendimiento, liofilización, ensamblaje químico y bioimpresión 3D

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Síntesis de hidrogeles de matriz extracelular de cartílago descelularizado

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...