Name: fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

Författarna vill erkänna W. Boot för stöd i produktionen av ställningar. K.E.M. Benders stöds av Alexandre Suerman Stipendium från University Medical Center. R. Levato och J. Malda stöds av holländska Arthritis Foundation (bidragsavtal CO-14-1-001 och LLP-12, respektive).

För detta protokoll erhölls equine kväva brosk från hästar som hade dött av andra orsaker än artros. Vävnaden erhölls med tillstånd från ägarna, i linje med de institutionella etiska reglerna.
Obs: Det här protokollet beskriver tillverkning av ställningar från cell-lösa equine brosk, som kan användas för applikationer såsom in vitro vävnadsodling plattformar eller för in-vivo implantation i regenerativ medicin strategier. Enzymatisk behan...

<ol>
	<li>Dunlop, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+functional+decline+in+older+adults+with+arthritis.">Risk factors for functional decline in older adults with arthritis.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).</li><li>Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+military+perspective+to+articular+cartilage+defects.">A military perspective to articular cartilage defects.</a> The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).</li><li>Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+chondral+defects+in+athletes'+knees:+a+systematic+review.">Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review.</a> Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).</li><li>Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+in+normal+and+osteoarthritis+conditions.">Cartilage in normal and osteoarthritis conditions.</a> Best practice &amp; research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).</li><li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering:+towards+a+biomaterial-assisted+mesenchymal+stem+cell+therapy.">Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy.</a> Current stem cell research &amp; therapy. 4 (4), 318-329 (2009).</li><li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine.">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li><li>Vashi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+for+Breast+Cancer+Patients+Undergoing+Mastectomy+and+Reconstruction+with+Use+of+DermACELL,+a+Sterile,+Room+Temperature+Acellular+Dermal+Matrix.">Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix.</a> Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).</li><li>Satterwhite, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+wall+reconstruction+with+dual+layer+cross-linked+porcine+dermal+xenograft:+the+&amp;#34;Pork+Sandwich&amp;#34;+herniorraphy.">Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the &amp;#34;Pork Sandwich&amp;#34; herniorraphy.</a> Journal of plastic, reconstructive &amp; aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+recellularization+of+human+tendon+scaffolds+using+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+and+collagen+gel.">Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).</li><li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration.">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li><li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Stromal+Cells+Outperform+Chondrocytes+on+Cartilage-Derived+Matrix+Scaffolds.">Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds.</a> Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).</li><li>Gawlitta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+cartilage-derived+matrix+as+substrate+for+endochondral+bone+regeneration.">Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration.</a> Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+repair+of+cartilage+defects+with+a+novel+acellular+cartilage+matrix+scaffold.">Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li><li>Meyer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+reduces+the+immune+response+to+aortic+valve+allografts+in+the+rat.">Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).</li><li>Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+and+remodeling+outcomes+in+response+to+biologic+scaffolds+with+and+without+a+cellular+component.">Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component.</a> Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).</li><li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response.">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization.">An overview of tissue and whole organ decellularization.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+men+and+elephants:+the+relation+between+articular+cartilage+thickness+and+body+mass.">Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass.</a> PloS One. 8 (2), e57683 (2013).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles.">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li><li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine:+mechanisms+of+in+vivo+remodeling.">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).</li></ol>

ECM av ledbrosk är mycket tät och ganska motståndskraftig mot olika enzymatiska behandlingar. Flerstegs decellularization protokollet beskrivs i denna artikel behandlar sådana motstånd och genererar framgångsrikt cell-lösa matriser. För att uppnå detta, spänner processen över flera dagar. Många decellularization processer har föreslagits för olika typer av vävnader18, och den här artikeln beskrivs ett protokoll som är lämplig för decellularization av brosk. I detta protokoll är...

Ledbrosk defekter i knät orsakas av traumatiska händelser kan leda till obehag, och framför allt kan ha en stor inverkan på livet för de unga och aktiva befolkningen1,2,3. Broskskador i unga år kan dessutom leda till en snabbare insättande av artros senare i livet4. För närvarande är den enda bärgning behandlingen för generaliserad artros i knä Ledbyteskirurgi. Brosk är en hypocellular, aneural och avaskulär vävnad, är dess regenerativ kapacitet starkt begränsad. Regenerativ medicin metoder är därför eftertraktade stöd och stimulera regenerativ kapacitet av infödda vävnad. För detta ändamål ställningar utformas och används som antingen en cell-bärare eller som en induktiv material som uppviglar differentiering och förnyelse av vävnad av kroppens infödda celler5.
Cell-lösa ställningar har studerats allmänt inom regenerativ medicin6. Det har haft viss framgång, till exempel i medhjälp förnyelse av huden7, buken strukturer8och senor9. Fördelen med att använda cell-lösa ställningar är deras naturligt ursprung och deras kapacitet att behålla bioaktiva ledtrådar som både lockar och inducera celldifferentiering in lämpliga släktlinje krävs för vävnad reparera6,10. Dessutom eftersom extracellulär matrix (ECM) är en naturlig biomaterial, och decellularization förhindrar en potentiell immunsvaret genom att ta bort cellular eller genetiska innehåll, är frågor rörande biokompatibilitet och biologisk nedbrytbarhet övervinnas.
Brosk-derived matris (CDM) ställningar har visat stor chondrogenic potential i in vitro-experiment när seedade med mesenkymala stromaceller11. Dessutom, har dessa ställningar visat potential att bilda benvävnad genom endochondral benbildning på ektopisk platser i invivo inställningar12. Som CDM ställningar guide bildandet av både ben och brosk vävnaden, dessa ställningar kan hålla potentiella för osteokondrala defekt reparation utöver brosk reparation.
Den här artikeln beskrivs ett protokoll som anpassas från Yang et al. (2010)13 för produktion av cell-lösa CDM ställningar från hästdjur kväva brosk. Dessa ställningar är rika i kollagen typ II och saknar celler, och innehåller inte någon glykosaminoglykaner (GAG) efter decellularization. Både in vitro- och in vivo försök på (osteoartrit) chondral defekt reparation kan utföras med hjälp av dessa ställningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cadaveric joint</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>180947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilization</td>
			<td>Synergy Health, Venlo, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>22561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dryer</td>
			<td>SALMENKIPP</td>
			<td>ALPHA 1-2 LD plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical mill</td>
			<td>IKA</td>
			<td>A 11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar/pestle</td>
			<td>Haldenwanger 55/0A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller plate</td>
			<td>CAT</td>
			<td>RM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (for 50 mL tubes)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule (cylindric mold)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>8 mm flat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superlight S UV</td>
			<td>Lumatec</td>
			<td>2001AV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve (mesh size 0.71 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34111229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laddle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized cartilage-derived matrix scaffolds

Osteokondrala defekter saknar tillräcklig inneboende reparation kapacitet att regenerera funktionellt ljud ben och brosk vävnaden. I denna utsträckning, har brosk forskning fokuserat på utvecklingen av regenerativ ställningar. Denna artikel beskriver utvecklingen av ställningar som helt härrör från naturliga brosk extracellulärmatrix, kommer från ett equine givare. Potentiella tillämpningar av ställningar inkluderar producerar organtransplantationer för brosk reparation, som fungerar som en klätterställning för osteokondrala tissue engineering och ge in vitro-modeller för att studera vävnad bildas. Av decellularizing vävnad, donatorcellerna tas bort, men många av de naturliga bioaktiva cues tros finnas kvar. Den största fördelen med att använda en sådan naturlig byggnadsställning i jämförelse med en syntetiskt framställd byggnadsställning är att ingen ytterligare funktionalisering av polymerer är skyldig att driva osteokondrala vävnadsregeneration. De brosk-derived matrix ställningar kan användas för ben och brosk vävnadsregeneration i både in vivo och in vitro-inställningar.

Decellularization av CDM ställningar måste alltid bekräftas med histologiska färgningar samt använda DNA kvantifiering för att mäta mängden DNA rester. Otillräcklig decellularization kan leda till oönskad immunologiska reaktioner som påverkar resultaten i invivo inställningar15,16,17. För denna specifika decellularization metod, DNA var nedanför detektionsområdet, som började på ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds at JoVE.com

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Cell-lösa brosk-derived ställningar kan användas som en byggnadsställning till guide brosk reparation och som ett sätt för att regenerera osteokondrala vävnad. Detta dokument beskriver hur decellularization i detalj och ger förslag att använda dessa ställningar i in vitro-inställningar.

Tillverkning av cell-lösa brosk-derived Matrix ställningar

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Denna metod presenterar ett sätt att skapa byggnadsställningar som härrör från inhemska vävnad som kan användas för brosk regenerering. Den största fördelen med denna teknik är att komponenter i inhemska brosk bevaras i de byggnadsställningar som kan främja broskbildning och regenerering in vitro och in vivo. Även om dessa metod använder brosk från häst kväva leder, brosk från alla andra leder kan användas också.Till att börja, erhålla en intakt cadaveric gemensamma för brosk isolering och ta bort huden överflödigt fett och muskelvävnad som beskrivs i den medföljande textprotokoll. Därefter definierar den plats där leden artikulerar genom att utföra förlängning böjning av leden. Gör ett horisontellt snitt för att nå ledhålan.Därefter gör en vertikal snitt för att öppna upp det gemensamma området. Den gemensamma håligheten är fylld med ledvätska som sannolikt kommer att droppa från hålrummet när de utför av korrekt snitt. Fortsätt att öppna upp leden helt genom att ta bort alltför fett, muskler och senor, och genom att skära genom senor som håller leden tillsammans.Inspektera försiktigt brosket för eventuella makroskopiska skador. Om ledbrosket inte har en glossier slät utseende eller om bevis, blåsor, klyftor eller defekter är närvarande, kassera brosk och börja om igen. Använd en steril skalpell för att ta bort brosket från benet.Skär hela vägen ner till subkondral ben för att ta bort den djupa zonen brosk. Samla de borttagna broskskivorna i 50 milliliterrör som innehåller tidigare beredd brosktvättlösning. Samtidigt som bearbetas, regelbundet droppa brosk tvättlösning på brosk för att förhindra att brosket torkar ut.Efter att ha samlat brosket från alla de områden av intresse, snap frysa brosk skivor i flytande kväve i fem minuter. Överför sedan broskskivorna i 50 milliliterrör och placerade omedelbart de frysta skivorna i en frystork. Lyofilisera brosket skivor i 24 timmar med frystork.När du är klar, förvara frystorkade broskskivor på en torr plats vid rumstemperatur. För manuell bearbetning, pre chill a mortel och mortelstöt med flytande kväve, sedan placera lyofiliserade brosk skivor i mortel och dränka dem och flytande kväve. Slipa direkt proverna för hand i cirka 45 minuter tills de är tillräckligt pulveriserade.Alternativt, för att slipa proverna automatiskt med hjälp av en fräsmaskin, börja med att förkyla fräsmaskinens slipfack genom att tillsätta flytande kväve. Tillsätt sedan lyofilaterade broskskivor och fräs provet med sin förinställda hastighet i några sekunder upp till en minut. Se till att alla partiklar är slipade och att inga partiklar stannar i botten av slipfacket.Slutligen, följa med decellularization tekniken som beskrivs i den medföljande text protokollet innan bildar byggnadsställningar. Överför brosket partiklar med en liten etikett till en cylindrisk plast mögel. Tryck alla luftbubblor ut för att undvika håligheter i ställningen och fyll formen helt.För att undvika håligheter i ställningenS, se till att luftbubblor pressas ut medan du fyller formen med broskpartiklar. Efter bildandet, frysa formen i 10 minuter vid minus 20 grader Celsius. Sedan lyophilize broskställningarna inom formen i 24 timmar i en frystork.Efter lyofilisering, ta försiktigt bort byggnadsställningen från formen. Placera ställningen under en 365 nanometer våglängd UV-ljus och tvärlänka den över natten. Bilda byggnadsställningsskivor genom att skära steriliserade byggnadsställningar i tre millimeter tjocka skivor.Överför sedan byggnadsställningarna i separata brunnar på en sex brunnsplatta. Tillsätt en milliliter Chondrocyte Expansion Medium ovanpå ställningar och låt dem rehydrera i 30 minuter. Medan byggnadsställningarna rehydrerar, förbereda cellerna och pipetten 50 mikroliter av den förberedda cellupphängningen ovanpå den preindränkta byggnadsställningen.Sedan inkubera ställningen i en timme vid 37 grader Celsius. När du använder kondrocyter, se till att de inte har utökats förbi den första passagen i syfte att minimera antalet differentierade celler. Efter en timme, returnera plattan till kulturhuven och försiktigt vända ställningen över.Pipettera de återstående 50 mikroliter av cellupphängning på byggnadsställningen och inkubera ytterligare en timme vid 37 grader Celsius. Tillsätt efter inkubation tre milliliter medium till brunnarna med byggnadsställningar. Undvik pipettering av mediet direkt på ställningar och hantera odlingsplattan försiktigt för att undvika att cellerna lossnar.Lämna tillbaka plattan till inkubatorn och odlingscellen överlät byggnadsställningar vid 37 grader Celsius. En kombination av historlogiska färgning och DNA-kvantifiering har använts för att visa att de metoder som presenteras i denna artikel resultera i tillräckliga brosk byggnadsställning decellularization. De resulterande byggnadsställningar befanns innehålla inga celler tillsammans med omätbara nivåer av DNA.De saknar också glykosaminoglykaner och är rika på kollagen II.Här observeras neomatrisbildning på byggnadsställning som översades med mesenkymala stamceller som var odlade i fyra veckor. Bildandet av glykosaminoglykaner är rikligt efter fyra veckor. Efter försök med den här proceduren är det viktigt att undersöka om decellularization har lyckats, innan du använder den i något program.Efter detta förfarande, ytterligare biokemiska analys som Western blot analysator kan utföras i syfte att svara på specifika frågor om förekomsten av andra komponenter såsom tillväxtfaktorer. Denna teknik banade väg för forskare inom vävnadsteknik att utforska strategier för broskregenerering med hjälp av decellulerad vävnad från allogena och syngeneiska källor. Försiktighetsåtgärder som att bära en labbrock och handskar bör alltid vidtas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitelceller Återplantering och framställning av gnagare Extracellular Matrix Byggnadsställningar för njurvävnad utveckling

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Tillverkning av mekaniskt Avstämbara och Bioactive Metal Byggnadsställningar för biomedicinska tillämpningar

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generation av ESC-derived mus epitelceller i luftvägarna med hjälp decellulariserade Lung Ställningar

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Tillverkning och karakterisering av Griffithsin modifierade Fiber ställningar för Prevention av sexuellt överförbara infektioner

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Tillverkning och användning av torra makroporösa alginatställningar för viral transduktion av T-celler

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Gelatinmetakryloylgranulära hydrogelställningar: Mikrogeltillverkning med hög genomströmning, frystorkning, kemisk montering och 3D-bioprinting

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Syntes av decellulariserade extracellulära matrishydrogeler för brosk

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Author Spotlight: Optimizing Bovine Lung Decellularization for Organotypic Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...