Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

وكان يؤيد هذا العمل "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (81772308) و "البحوث الرئيسية الوطنية" و "برنامج التنمية في الصين" (رقم 2017YFA0205502).

رعاية كافة الأساليب التي تشمل الحيوانات الحية وأجريت وفقا للحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية لجامعة جنوب شرق الصين.
1-إعداد بي-سبيونس
<ol><li>
إعداد تعديل لحمض الأولييك سبيونس
	<ol>
<li>حل فيكل3•6H2س وفيسو4•7H2س في الماء تحت حماية ن2.<ol>
<li>إضاف?...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

الضامة الصهر ترانسفيكت بنهج فاجيناليس شائعة الاستخدام، مثل انهانسر والدهنية الأيوني، وأنواع الدهن. هنا وصفت لنا طريقة موثوقة وفعالة ترانسفيكت الضامة مع siRNA. باستخدام هذا البروتوكول، ما يزيد على 90% من مثل بلعم 264.7 الخام الخلايا (الشكل 2B) والفئران الضامة البريتوني1...

الضامة نوع من الخلايا المناعية الفطرية التي وزعت في جميع أنسجة الجسم، أن كان ذلك بمقادير مختلفة. بإنتاج مجموعة متنوعة من السيتوكينات والوسطاء الآخرين، أنها تلعب أدواراً حاسمة في الدفاع المضيف ضد غزو الجراثيم المسببة للأمراض وفي إصلاح الأنسجة بعد الإصابة، وفي الحفاظ على التوازن الأنسجة1. بسبب أهميتها، قد الضامة باستمرار موضوع البحث المكثف. ومع ذلك، على الرغم من انتشاره في تنظيم الجينات ودراسات مهمة، إسكات الجينات siRNA بوساطة أقل احتمالاً لينجح في الضامة لهذه الخلايا – خاصة، الضامة الأولية – غالباً ما تكون صعبة ترانسفيكت. وهذا يمكن أن يعزى إلى درجة عالية نسبيا من السمية المرتبطة بنهج تعداء الأكثر الراسخة التي يكون فيها غشاء الخلية كيميائيا (مثلاً، مع البوليمرات والدهون) أو ماديا (مثلاً، انهانسر و تعطل الجينات البنادق) للسماح siRNA الجزيئات عبر الغشاء، الحد بشكل كبير وبالتالي الضامة جدوى2،3. وعلاوة على ذلك، يتم الضامة الغنية في إنزيمات بوليمرات مخصصة البالعات. يمكن أن تتلف هذه الإنزيمات سلامة siRNA، إضعاف كفاءته إسكات حتى إذا تم تسليم siRNA الخاصة بالجينات في الخلية3،4. ولذلك، يحتاج نظام تسليم siRNA فعالة تستهدف بلعم لحماية سلامة واستقرار siRNA أثناء تسليم4.
من الواضح بصورة متزايدة أن الضامة مختلة متورطون في بدء وتطور بعض الاضطرابات السريرية الشائعة مثل أمراض المناعة الذاتية، وتصلب الشرايين والسرطان. ولهذا السبب، تحوير وظيفة بلعم مع، على سبيل المثال، siRNA، الناشئة بطريقة جذابة لعلاج هذه الاضطرابات5،،من67. على الرغم من أن قدرا كبيرا من التقدم قد أحرز، تحديا رئيسيا لاستراتيجية العلاج القائم على siRNA من خصوصية خلية الفقراء siRNA تدار النظامية وامتصاص siRNA غير كافية بالضامة، مما يؤدي بالتالي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها. بالمقارنة مع العلاجات مجاناً الحمض النووي التي تفتقر عادة إلى الانتقائية الخلية المثلى، وغالباً ما يؤدي إلى آثار سلبية، محملة بالمخدرات جسيمات نانوية (NPs)، سبب ميلها العفوي لإلقاء القبض عليه من قبل نظام شبكي، الهدف يمكن أن يكون إجراء هندسة عكسية لاستهداف السلبي إلى الضامة في فيفو، مما يسمح لتحسين الفعالية العلاجية مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية8. وتشمل NPs الحالية استكشافها لإيصال جزيئات الحمض النووي الريبي نانوكاريرس غير العضوية والدهنية المختلفة والبوليمرات9. فيما بينها، بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد)، نوع من البوليمرات الموجبة قادرة على الربط والتكثيف الأحماض النووية إلى استقرار مصادر القدرة النووية، يظهر أعلى الجيش الملكي النيبالي تسليم9،قدرة10. برينس يحمي الأحماض النووية من تدهور الانزيمية ونونينزيماتيك ويتوسط نقلها عبر غشاء الخلية، ويعزز الإفراج عنهم داخل الخلايا. على الرغم من أن عرض في البداية ككاشف إيصال الحمض النووي، تجلى بي فيما بعد لتكون منصة جذابة في فيفو siRNA التسليم، أما محلياً أو عناصره9،10.
جسيمات نانوية أكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك (سبيونس) وقد أظهرت وعدا كبيرا في الطب الحيوي، وسبب خصائص مغناطيسية، توافق مع الحياة، وحجم مماثلة إلى كائنات هامة بيولوجيا، وارتفاع نسبة مساحة السطح إلى حجم، ويمكن تكييفها بسهولة سطح بيواجينت المرفق11. على سبيل المثال، بسبب فائدتها المحتملة كعامل تباين وسرعة امتصاص الضامة، ظهرت سبيونس كأداة سريرية مفضلة لصورة الأنسجة الضامة12. بينما كما درست سبيونس على نطاق واسع الأحماض النووية تسليم المركبات11،13،14،15، على حد علمنا، الأدب يحتوي على عدد قليل من التقارير من سبيونس كناقل تسليم siRNA بلعم المستهدفة. لإيصال الجينات سبيونس، هي عادة مغلفة سطحها بطبقة من ماء البوليمرات الموجبة التي الأحماض النووية المشحونة سلبيا يمكن الكهربية الاستاتية جذبت والمربوطة. وهنا نقدم طريقة لتجميع سبيونس السطحية التي يتم تعديل مع منخفضة الوزن الجزيئي (كاتشين 10)، تشعبت بي (بي-سبيونس). ثم تستخدم هذه نانوبلاتفورمس المغناطيسي لاختصار siRNA، تشكيل مجمعات بي-جاسوس/siRNA تمكن siRNA النقل داخل الخلية. نحن السبب أن البلعمه عفوية من سبيونس من خلايا نظام شبكي16، مقترنة بقدرة قوية للربط والتكثيف الأحماض النووية بجزيرة الأمير إدوارد، يجعل بي--سبيونس مناسبة للنقل تتسم بالكفاءة ل siRNA في الضامة. دعم البيانات المقدمة هنا جدوى إسكات الجينات بي-جاسوس/siRNA-وساطة في الضامة في الثقافة، وكذلك في فيفو.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

بسبب دورها الحاسم في تنظيم الاستجابات المناعية، الضامة خضعت بشكل مستمر من البحث المكثف، وتمثل هدفا علاجية واعدة في اضطرابات كثيرة، مثل أمراض المناعة الذاتية، وتصلب الشرايين، والسرطان. إسكات الجينات بوساطة [رني] نهج قيمة الاختيار للتحقيق والتعامل مع الدالة بلعم؛ ومع ذلك، تعداء الضامة مع siRNA ويعتبر غالباً ما تكون صعبة من الناحية التقنية، وفي الوقت الحاضر، تتوفر بعض المنهجيات مخصصة لنقل siRNA إلى الضامة. نقدم هنا، على بروتوكول لاستخدام جسيمات نانوية المغلفة بولييثيلينيميني أكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك (بي-سبيونس) كوسيلة لإيصال siRNA المستهدفة إلى الضامة. بي-سبيونس قادرون على الملزمة والتكثيف siRNA تماما عندما تصل نسبة وزن الحديد: siRNA 4 وما فوقها. في المختبر، هذه الجسيمات النانوية يمكن أن كفاءة تسليم siRNA الضامة الأولية، وكذلك في خط الخلية 264.7 الخام مثل بلعم، دون تعريض بقاء الخلية في الجرعة المثلى تعداء،، وفي نهاية المطاف، أنها تحفز الهدف بوساطة siRNA إسكات الجينات. وبصرف النظر عن تستخدم في المختبر تعداء siRNA، بي-سبيونس أيضا أداة واعدة لتقديم siRNA الضامة في فيفو. وبالنظر إلى ميزاته مجتمعة الخاصية المغناطيسية والقدرة على إسكات الجينات، ينتظر تدار النظامية بي-جاسوس/siRNA الجسيمات تعدل الدالة بلعم بل أيضا لتمكين الضامة إلى تصويرها وتعقبها. في جوهرها، بي-سبيونس تمثل منبرا فاجيناليس بسيطة وآمنة وفعالة لإيصال siRNA إلى الضامة على حد سواء في المختبر و في فيفو.

حجم وزيتا إمكانات بي-سبيونس أعد مع هذا البروتوكول كانت في حدود 29-48 نيوتن متر (polydispersity الفهرس: 0.12-0.23) والسيارات من 30-48، على التوالي. كانت مستقرة في الماء عند 4 درجة مئوية لأكثر من 12 شهرا دون تجميع واضحة. تقييم siRNA على ربط القدرة، كانت مختلطة بي-سبيونس مع siRNA في نسب وزن الحديد: siRN...

Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

يصف لنا طريقة استخدام بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد)-مغلف بأكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك جسيمات نانوية الضامة ترانسفيكتينج مع siRNA. يمكن تقديم هذه الجسيمات النانوية كفاءة siRNA الضامة في المختبر و في فيفو والصمت في التعبير الجيني المستهدف.

جسيمات نانوية المغلفة بولييثيلينيميني أكسيد الحديد كوسيلة لإيصال الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة إلى الضامة في المختبر و في فيفو

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على الأسئلة الرئيسية. في مجال علم الإنسان. تلك الإجابة في وظيفة الضامة تحت نهاية الفسيولوجية للحالات المرضية.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البولي إثيلينمين المغلفة يمكن بكفاءة في المختبر دون المساس الخلية. تحت الجرعات المثلى. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج والتشخيص للعديد من الاضطرابات الالتهابية المزمنة والسرطانات.حيث الضامة تلعب دورا أساسيا في التسبب في الأمراض. إثبات الإجراء سيكون نا جيا. طالب دراسات عليا من مختبريو (كايشوان وانغ) طالب دراسات عليا من مختبر الدكتور (شياو هوا) لإعداد حمض الحلفاء المعدل السوبر paramagnetic أكسيد الحديد الجسيمات النانوية أو SPION 'sاول إضافة 28 غراما من كلوريد الفراس الهكده. و 20 غراما pharas selfate heptahydrate إلى beaker تحتوي على 80 ملليلتر من المياه الأيونية.واستخدم قناة زجاجية لإدخال النيتروجين في الحل. التحريك حتى يذوب المادة الصلبة. سخني خليط التفاعل إلى 72 درجة مئوية مع التحريك عند 800 دوران في الدقيقة.وإضافة 40 ملليلتر من 28٪ من ماء الأمونيا إلى القارض. بعد خمس دقائق إضافة تسعة ملليلتر من حمض الحلفاء قطرة الحكمة. والحفاظ على الخليط في 72 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات مع اثارة مستمرة.في نهاية الحضانة تبريد الحل الناتج عن درجة حرارة الغرفة. ويعجل الخليط عن طريق فصل المغناطيسي وفقا للبروتوكولات القياسية. ثم غسل SPION التي تحتوي على عجل ثلاث مرات مع الكحول الإيثيلي المطلق.و asperse العجل في 100 ملليلتر من ن-هكسيان. لإعداد dimercapto حمض الاكريليك تعديل SPION إضافة 800 ملليغرام من حمض الحلفاء المعدلة SPION. مشتتة في 200 ملليلتر من ن-هكسيان و 400 ملليغرام من حمض الاكريليك dimercapto المنتشرة في 200 ملليلتر من الأسيتون في قارورة الرقبة الثلاث في حمام مائي في 60 درجة مئوية.أضف المقبل 200 ميكرولترات من ثلاثية الإيثيلامين قطرة الحكمة إلى قارورة مع اثارة في تناوب 1000 في الدقيقة الواحدة و refluxing. ويمكن الحصول على عجل أسود عن طريق فصل المغناطيسي بعد خمس ساعات. ثم استخدام هيدروكسيد رباعي الميثيليوم لضبط درجة الH من الحل لتشتت متجانس من سبيون هيدروفيلي في المياه الأيونية.البوليEthyleneimine المغلفة يبون إضافة حمض الاكريليك dimercapto تعديل حل SPION الغروية إسقاط الحكمة في حل البولي إثيلينمين 10 كيلودالون. في 500 ملليلتر ثلاث قارورة الرقبة تحت التحريك الميكانيكية في تناوب 1000 في الدقيقة لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة إضافة الحل الناتج إلى أنبوب الترشيح فائقة مع قطع الوزن الجزيئية من 100 كيلودالتون ومحتوى 15 ملليلتر.10- سترافوس العينة حتى يصل الحل المتبقي إلى حجم مليلتر واحد. إضافة المياه غير المؤينة إلى الحل لإعادة حجم إلى 15 ملليلتر. ووسترا وrhydse الحل عشر مرات أكثر كما أظهرت للتو.ثم تصفية الحل من خلال مرشح 22 ميكرون للتخزين في أربع درجات مئوية. لإعداد جسيمات نانوية سيرنا أولا إضافة ثلاثة microliters من الطازجة 20 أعدت حلول siRNA micromolar إلى خمسة يسمى أنابيب الحمض النووي الريبي الحرة microcentroa التي تم تجهيزها. وإضافة 0، 8، 1.6، 3.2، و 6.4 ميكروغرام من البولي إثيلينمين SPION إلى أنابيب تحمل اسم صفر، واحد، اثنين، أربعة، وثمانية على التوالي.بعد خلط مع الأنابيب لطيف، احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للمجمعات البولي ايثيلينمين SPION سيرنا لتشكيل. و إعداد 3 في المئة agarose هلام مع أنا النقاء agarose. في نهاية الحضانة إضافة ميكرولتر واحد من 6X الحمض النووي تحميل العازلة لكل خمسة ميكرولترات من عينة لكل أنبوب ومزيج بعناية.ثم تحميل كل من العينات على هلام. وتشغيل الكهرباء في خمسة فولت لكل سنتيمتر. حتى صبغة بروموفينول الزرقاء هجرة ثلثي الطول على الجل.يوم واحد قبل transfection غسل الماوس microphage مثل RAW264.7 خلية ثقافة مع برنامج تلفزيوني. وعلاج الخلايا مع ملليلتر واحد من 25٪ التربسين لمدة خمس إلى عشر دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة خمسة في المئة. عندما تكون غالبية الخلايا قد انفصلت.إلغاء تنشيط التربسين مع خمسة ملليلتر من DMEN كاملة. ثم pippete الحل عدة مرات لتفريق أي مجموعات الخلية. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب كوناكل معقمة 15 ملليلتر للطرد المركزي.ثم قم بتعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من DMEN كاملة جديدة للعد. تخفيف الخلايا إلى 4.5 مرات عشرة إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر من تركيز DMEN الكامل. وإضافة مليلترين من المتوسط إلى كل بئر من ستة بئر لمدة 24 ساعة حضانة في حاضنة ثقافة الخلية.في اليوم التالي إعداد النسبة المناسبة من البولي ايثيلينمين SPION سيرنا النانوية في 1.5 ملليلتر RNA تيار microcentrifuge أنبوب مع خلط لطيف كما هو موضح للتو. وإضافة الحجم المناسب من البولي ايثيلينمين SPION SIION نانو جسيمات مجمع لكل بئر الذي تم استبداله مع ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة. إعداد البولي ايثيلينمين SPION si المجمعات.في هذا المثال يمكن استخدام العديد من أشهر البولي ايثيلينمين سبون وبالتالي تقليل سميتها المحتملة. ثم دوامة لوحة بعناية لتحقيق توزيع متكافئ من الجسيمات النانوية عبر قيعان البئر. العودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية حتى التحديث الخلوية اللاحقة أو تحليل نقص الضربة القاضية الجينات.Polyethyleneimine SPION مع قدرة زيتا 30.5 و 37 ملليفولت لا يحمل سمية cyto واضح في تركيزات تصل إلى 30 ميكروغرام من الحديد لكل ملليلتر. وهو حوالي استئجار أضعاف اثنين من التركيز المستخدم عادة لtransfefection الخلية. البولي ايثيلينمين سبون في إمكانات زيتا 48 millivolts ولكن سامة.حتى في أقل جرعة فحصها. كما تم تحليلها بواسطة قياس الخلايا المتدفقة، يمكن أن تكون أكثر من 90٪ من الخلايا مصابة بالفلوري المسمى بوليثيلينمين SPION siRNA في مجمعات 15 ميكروغرام من الحديد لكل ملليلتر. تقييم آثار تركيزات البولي ايثيلينمين SPION سيرنا على استيعاب الخلايا عن طريق سحق تلطيخ الأزرق يكشف عن تلطيخ يمكن اكتشافه في 7.5 ميكروغرام من الحديد لكل ملليلتر.ولكن البقع واضحة للعيان في 15 ميكروغرام من الحديد لكل ملليلتر التي لا تزيد في تركيزات أعلى من الحديد من المرجح أن يرجع إلى البولي ايثيلينمين SPION سيرنا امتصاص التشبع. الضامة البريتونية transphages مع البوليEthyleneimine SPION إيواء محددة siRNA المعرض انخفاضا كبيرا في مستويات مرنا targe مقارنة مع غير محددة سيرنا. مما يشير إلى أن سيرنا يمكن الهروب من vesicles endocytic في السيتوبلازم للوصول إلى آلية تدخل الحمض النووي الريبي.كذلك بعد الحقن الوريدي من جرعة واحدة من البولي ايثيلينمين SPION siRNA مجمعات نانو جسيمات flocentimetrical تحليل الخلايا الإيجابية CD11b وD3 يكشف عن امتصاص أكثر كفاءة من الجسيمات النانوية من CD11b التعبير عن الضامة من الخلايا الإيجابية CD3 في أي وقت في جميع الأجهزة فحص. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تحضر البولي ايثيلينمين سبيون مع متوسط البيانات المحتملة لا يزيد عن 37 millivolts وإعداد مجمعات البولي ايثيلينمين SPION سيرنا على نسب منخفضة من الحديد إلى الـ سيرنا. هذه التقنية تقارن بين حاجة الباحثين لاستكشاف الإمكانات العلاجية لاستهداف الضامة في المحركات الحيوانية للمرض البشري مثل والسرطان.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

استراتيجية لتحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

بطء الإفراج تسليم المخدرات من خلال Elvax 40W إلى الجرذ الشبكية: الآثار المترتبة على علاج الحالات المزمنة

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

عزل وعن طريق أقسام الأبقار الشريان والوريد المساريقي باعتباره الأحيائي لاختبار لVasoactivity في الأمعاء الدقيقة

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

القياس عن بعد داخل الرحم لقياس ماوس مقلص الضغط<em&gt; في فيفو</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

حديثي الولادة الفئران كوكلار تقنية إكسبلانت باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; أداة الفحص في أبحاث السمع

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

في فيفو تقييم التنمية دشبذ الكسر أثناء التئام العظام في الفئران باستخدام جهاز الصدمة المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي لعظم الفخذ الماوس

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...