Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81772308) og nationale nøglen forskning og udvikling Program i Kina (nr. 2017YFA0205502).

Alle metoder der involverer levende dyr blev udført i overensstemmelse med dyrets pleje og bruge retningslinjerne fra sydøst University, Kina.
1. forberedelse af PEI-SPIONs
<ol><li>
Forberedelse af oliesyre-modificerede SPIONs
	<ol>
<li>Opløs FeCl3•6H2O og FeSO4•7H2O i vand under beskyttelse af N2.<ol>
<li>Tilføje 28 g FeCl3•6H,2O- og 20 g FeSO4•7H,2O i 80 mL deioni...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

Makrofager er refraktære over for transfect af almindeligt anvendte nonviral tilgange, såsom elektroporation, kationiske Liposomer og lipid arter. Her beskrev vi en pålidelig og effektiv metode til at transfect makrofager med siRNA. Ved hjælp af denne protokol, kan over 90% af makrofag-lignende RAW 264.7 celler (figur 2B) og rotte peritoneal makrofager18 være transfekteret med siRNA uden væsentlig forringelse af cellernes levedygtighed. Denne metode afhænger le...

Makrofager er en type af medfødte immun celler fordelt i alle kroppens væv, omend i forskellige mængder. Ved at producere en bred vifte af cytokiner og andre mæglere, spiller de vigtige roller i vært forsvaret mod invaderende mikrobielle patogener, væv reparation efter skade og opretholde væv homøostase1. På grund af deres betydning, har makrofager konstant været genstand for intensiv forskning. Men trods dens udbredelse i genregulering og funktion undersøgelser, siRNA-medieret genhæmning er mindre tilbøjelige til at lykkes i makrofager, fordi disse celler — især primære makrofager – er ofte vanskelige at transfect. Dette kan tilskrives en relativt høj grad af toksicitet forbundet med mest veletablerede Transfektion tilgange, hvor cellemembranen er kemisk (f.eks.med polymerer og lipider) eller fysisk (f.eks.af elektroporation og gen kanoner) afbrudt for at lade siRNA molekyler passere membranen, hvorved drastisk at reducere makrofager levedygtighed2,3. Derudover er makrofager dedikeret fagocytter rig på degradative enzymer. Disse enzymer kan skade integriteten af siRNA, svække dens silencing effektivitet selv om gen-specifikke siRNA har været leveret i celle3,4. Derfor, en effektiv makrofag-målrettet siRNA leveringssystemet skal beskytte integritet og stabilitet af siRNA under levering4.
Det bliver stadig mere tydeligt, at dysfunktionel makrofager er impliceret i indledningen og progression af visse fælles kliniske lidelser som autoimmune sygdomme, åreforkalkning og kræft. Derfor modulerende makrofag funktion med eksempelvis siRNA har været fremstår som en attraktiv metode til behandling af disse lidelser5,6,7. Selv om mange fremskridt, er en stor udfordring for siRNA-baseret behandlingsstrategi fattige celle specificiteten af systemisk administreret siRNA og utilstrækkelig siRNA optagelsen af makrofager, hvilket derfor føre til uønskede bivirkninger. Sammenlignet med gratis nukleinsyre therapeutics, der normalt mangler optimal celle-selektivitet og ofte føre til uønskede virkninger, medicin-loaded nanopartikler (NPs), på grund af deres spontane tilbøjelighed for at blive fanget af det Retikuloendoteliale system, off mål kan være udviklet til passiv målretning til makrofager i vivo, giver mulighed for forbedrede terapeutiske virkning med minimale bivirkninger8. Nuværende NPs undersøgt for levering af RNA molekyler omfatter uorganiske nanocarriers, forskellige Liposomer og polymerer9. Blandt dem viser polyethyleneimine (PEI), en type af kationiske polymerer i stand til at binde og kondenserende nukleinsyrer i stabiliseret NPs, den højeste RNA levere kapacitet9,10. PEI beskytter nukleinsyrer fra enzymatiske og nonenzymatic nedbrydning, formidler deres overførsel på tværs af cellemembranen og fremmer deres intracellulære frigivelse. Selvom oprindeligt indført som en DNA levering reagens, blev PEI efterfølgende påvist for at være en attraktiv platform for i vivo siRNA levering, enten lokalt eller systemisk9,10.
Superparamagnetisk jernoxid nanopartikler (SPIONs) har vist gode løfte i biomedicin, på grund af deres magnetiske egenskaber, biokompatibilitet, sammenlignelig størrelse til biologisk vigtige objekter, høj overflade-areal-til-volumen forhold, og let at tilpasse overflade for bioagent vedhæftet fil11. For eksempel, på grund af deres potentielle nytteværdi som et kontraststof og hurtig udbredelse af makrofager, SPIONs er dukket op som en favorit klinisk værktøj til billede væv makrofager12. Mens SPIONs har også blevet grundigt undersøgt som nukleinsyre levering køretøjer11,13,14,15, at vores viden, indeholder litteraturen få rapporter om SPIONs som transportør for makrofag-målrettet siRNA levering. Gen levering af SPIONs, er deres overflade normalt belagt med et lag af hydrofile kationiske polymerer som negativt ladede nukleinsyrer kan elektrostatisk tiltrukket og tøjret. Vi præsenterer her, en metode til at syntetisere SPIONs hvis overflade er modificeret med lav molekylvægt (10 kDa), forgrenede PEI (PEI-SPIONs). Disse magnetiske nanoplatforms er derefter ansat til at kondensere siRNA, danner PEI-SPION/siRNA komplekser, der aktiverer siRNA transport ind i cellen. Vi grund at spontane fagocytose af SPIONs af celler i Retikuloendoteliale system16, kombineret med den stærke evne af bindende og kondenserende nukleinsyrer ved PEI, gengiver PEI-SPIONs egnet til effektiv transport af siRNA ind makrofager. De data præsenteres her støtte gennemførligheden af PEI-SPION/siRNA-medieret genhæmning i makrofager i kultur samt in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

På grund af deres vigtige rolle i regulering af immunrespons, makrofager har konstant været genstand for intensiv forskning og repræsenterer et lovende terapeutiske mål i mange lidelser, såsom autoimmune sygdomme, åreforkalkning og kræft. RNAi-medieret genhæmning er en værdifuld tilgang af valg for at undersøge og manipulere makrofag funktion; dog Transfektion af makrofager med siRNA er ofte anset for at være teknisk udfordrende, og på nuværende tidspunkt få metoder dedikeret siRNA overførsel til makrofager er tilgængelige. Vi præsenterer her, en protokol for at bruge polyethyleneimine-belagte superparamagnetisk jernoxid nanopartikler (PEI-SPIONs) som et redskab til målrettet levering af siRNA til makrofager. PEI-SPIONs er i stand til af bindende og helt kondenserende siRNA når Fe: siRNA vægtforhold når 4 og derover. In vitro, disse nanopartikler effektivt kan levere siRNA primære makrofager og til makrofag-lignende RAW 264.7 cellelinje, uden at kompromittere cellernes levedygtighed på den optimale dosis til Transfektion, og i sidste ende, de fremkalde siRNA-medieret target genhæmning. Bortset fra anvendes til in vitro- siRNA Transfektion, er PEI-SPIONs også et lovende redskab til at levere siRNA til makrofager i vivo. I betragtning af sin kombinerede funktioner af magnetiske ejendom og genhæmning evne forventes systemisk administreret PEI-SPION/siRNA partikler ikke kun at modulere makrofag funktion, men også at aktivere makrofager at blive afbildet og spores. I det væsentlige, PEI-SPIONs repræsenterer en enkel, sikker og effektiv nonviral platform for siRNA levering til makrofager både in vitro- og in vivo.

Størrelse og zeta potentiale af PEI-SPIONs tilberedt med denne protokol var indenfor rækkevidde af 29-48 nm (polydispersity indeks: 0,12 - 0,23) og 30-48 mV, henholdsvis. De var stabile i vand ved 4 ° C for over 12 måneder uden indlysende sammenlægning. For at vurdere deres siRNA bindende evne, blev PEI-SPIONs blandet med siRNA på forskellige Fe: siRNA vægt nøgletal. Figur 1 viser, at når Fe: siRNA vægtforhold når 4 og derover, bandet af gratis siR...

Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Vi beskriver en metode til at bruge polyethyleneimine (PEI)-belagt superparamagnetisk jernoxid nanopartikler til transfecting makrofager med siRNA. Disse nanopartikler kan effektivt levere siRNA til makrofager i in vitro og i vivo og stilhed target genekspression.

Polyethyleneimine-belagt jernoxid nanopartikler som et køretøj til levering af små interfererende RNA til makrofager In Vitro og In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Denne foranstaltning kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål. Inden for humanologi. Dette svar i funktionen af makrofager under fysiologiske ende af patologiske forhold.Den største fordel ved denne teknik er, at polyethylenimin belagt effektivt kan en vitro uden at gå på kompromis celle. Under optimale doser. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod terapi og diagnose af mange kroniske inflammatoriske lidelser og kræft.Hvor makrofager spiller en afgørende rolle i patogenesen. Demonstration af proceduren vil være Na Jia. En kandidatstuderende fra mit laboratorium.Og Kaixuan Wang en kandidat studerende fra Dr.Xiaohua's lab. For at forberede allyl syre modificeret super paramagnetisk jernoxid nanopartikler eller SPION første tilføje 28 gram farorchlorid hexahydrat. Og 20 gram pharas selfate heptahydrat til et bægerglas, der indeholder 80 milliliter deioniseret vand.Og brug en glasledning til at indføre kvælstof i opløsningen. Omrøring, indtil det faste stof er opløst. Reaktionsblandingen opvarmes til 72 grader Celsius med omrøring ved 800 rotationer i minuttet.Og tilsæt 40 milliliter 28% ammoniak vand til bægerglasset. Efter fem minutter tilsættes ni milliliter allieret syre dråbe klogt. Og vedligeholde blandingen ved 72 grader Celsius i tre timer med kontinuerlig omrøring.Ved slutningen af inkubationen afkøles den resulterende opløsning til stuetemperatur. Og udfælde blandingen via magnetisk adskillelse i henhold til standardprotokoller. Derefter vaskes DEN SPION, der indeholder bundfald tre gange med absolut ethylalkohol.Og asperse bundfaldet i 100 milliliter n-hexan. For at forberede dimercapto akrylsyre modificeret SPION's tilføje 800 milligram af allieret syre modificeret SPION's. Dispergeret i 200 milliliter n-hexan og 400 milligram dimercapto akrylsyre dispergeret i 200 milliliter acetone i en tre halskolbe i et vandbad ved 60 grader Celsius.Dernæst tilsættes 200 mikroliter triethylamin dråbe klogt til kolben under omrøring ved 1000 omdrejninger i minuttet og refluksing. En sort bundfald kan opnås ved magnetisk adskillelse efter fem timer. Brug derefter tetramethylammoniumhydroxid til at justere pH-slutningen af opløsningen til homogen dispergering af de hydrofile SPION'er i deioniseret vand.Degenereret polyethyleneimin belagt SPION's tilføje dimercapto akrylsyre modificeret SPION's kolloid opløsning dråbe klogt i en 10 kilodalton polyethylenimin opløsning. I en 500 milliliter tre hals kolbe under mekanisk omrøring ved 1000 omdrejninger i minuttet i to timer. Ved slutningen af inkubationen tilsættes den resulterende opløsning til et ultrafiltreringsrør med en molekylvægt afskåret på 100 kilodaltons og et indhold på 15 milliliter.Centrafuse prøven, indtil den resterende opløsning når en milliliter volumen. Tilsæt deioniseret vand til opløsningen for at bringe lydstyrken tilbage til 15 milliliter. Og centrafuse og rehydrere løsningen ti gange mere som netop påvist.Derefter filtreres opløsningen gennem et 22 mikronfilter til opbevaring ved fire grader Celsius. For at forberede siRNA nanopartiklerne først tilføje tre mikroliter af frisklavede 20 mikromolar siRNA-løsninger til fem mærket RNA's frie mikrocentroafused rør. Og tilsæt 0, 8, 1,6, 3,2 og 6,4 mikrogram polyethyleneimine SPION's til rør mærket nul, en, to, fire og otte.Efter blanding med blid pipetning inkuberes prøverne i 30 minutter ved stuetemperatur, så polyethyleneimine SPION siRNA-komplekserne kan dannes. Og forberede en tre procent agarose gel med jeg renhed agarose. Ved slutningen af inkubationen tilsættes en mikroliter 6X DNA-belastningsbuffer pr. fem mikroliter prøve til hvert rør og blandes omhyggeligt.Læg derefter alle prøverne på gelen. Og køre elektroforese på fem volt per centimeter. Indtil bromophenol blå farvestof migrerer to tredjedele af længden på gelen.En dag før transfektionen vaske en mus mikrobhage som RAW264.7 celle kultur med PBS. Og behandle cellerne med en milliliter på 25% trypsin i fem til ti minutter ved 37 grader Celsius i en fem procent kuldioxid inkubator. Når størstedelen af cellerne er afmonteret.Inaktiver trypsin med fem milliliter komplet DMEN. Derefter pippete løsningen flere gange for at sprede eventuelle celleklynger. Cellesuspension overføres til et sterilt 15 milliliter conackelrør til centrifugering.Derefter re suspendere cellerne i fem milliliter frisk komplet DMEN til optælling. Cellerne fortyndes til 4,5 gange ti til de fjerde celler pr. milliliter fuldstændig DMEN-koncentration. Og tilsæt to milliliter medium til hver brønd af en seks brøndplade til en 24 timers inkubation i cellekulturinkubatoren.Den næste dag forberede passende forhold mellem polyethyleneimin SPION siRNA nanopartikler i en 1,5 milliliter RNA stream mikrocentrifuge rør med blid blanding som netop påvist. Og tilsæt passende volumen af polyethyleneimin SPION siRNA nanopartikel kompleks til hver brønd, som er blevet erstattet med en milliliter frisk medium. Forbered polyethyleneimin SPION si komplekser.i dette tilfælde mange flere måneder af polyethylenimin SPION kan anvendes Dermed minimere deres potentielle toksicitet. Så hvirvle pladen omhyggeligt for at opnå en jævn fordeling af nanopartikler på tværs af brønden bunde. Returner pladen til cellekulturinkubatoren, indtil den efterfølgende celleopdatering eller gen knockdown-mangelanalyse.Polyethyleneimin SPION'er med et zetapotentiale på 30,5 og 37 millivolt udviser ikke en tilsyneladende cytotoksicitet ved koncentrationer på op til 30 mikrogram jern pr. milliliter. Hvilket er omkring to gange leje end den koncentration, der normalt anvendes til celle transfektion. Polyethyleneimin SPION's zeta potentiale på 48 millivolt er dog giftige.Selv ved den lavest undersøgte dosis. Som analyseret af flow cytometri, mere end 90% af cellerne kan transintinficeres med fluorescerende mærket polyethylenimin SPION siRNA komplekser på 15 mikrogram jern per milliliter. Vurdering af virkningerne af polyethyleneimine SPION siRNA koncentrationer på cellulære internalisering ved knusning blå farvning afslører minimalt påviselig farvning på 7,5 mikrogram jern pr. milliliter.Men klart synlige pletter på 15 mikrogram jern pr. milliliter, der ikke stiger ved højere koncentrationer af jern sandsynligvis på grund af polyethylenimin SPION siRNA optagelse mætning. Peritoneal makrofager transficeret med polyethyleneimin SPION's husly specifikke siRNA udviser et betydeligt fald i targe mRNA niveauer sammenlignet med uspecifik siRNA. Tyder på, at siRNA kan flygte fra endocytiske vesikler ind i cytoplasmaet for at nå RNA interferens maskiner.Efter intravenøs injektion af en enkelt dosis polyethyleneimin SPION siRNA nanopartikel komplekser flocentimetrisk analyse af CD11b positive og CD3 positive celler afslører en mere effektiv optagelse af nanopartikler ved CD11b udtrykke makrofager end ved CD3 positive celler på noget tidspunkt i alle de undersøgte organer. Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske at forberede polyethylenimin SPION's med et gennemsnitligt datapotentiale ikke højere end 37 millivolt og at forberede polyethyleneimine SPION siRNA komplekser på det lave jern til siRNA-forhold. Denne teknik sammenligner behovet for forskere til at udforske terapeutiske potentiale for at målrette makrofag i dyremotorer af menneskelige sygdomme som og kræft.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoksiske Stimulering af Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Slow-release Drug Delivery gennem Elvax 40W til rotteretina: konsekvenser for behandlingen af ​​kroniske lidelser

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Isolering og bruger sektioner af Bovin mesenterialarterie og Vein som et bioassay til at teste for Vasoactivity i tyndtarmen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetri måler Mouse kontraktile Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool i Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro og In Vivo påvisning af Mitophagy i humane celler, C. Elegansog mus

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluering af fraktur Callus udvikling under knogleheling i mus ved hjælp af en Mr-kompatible osteosyntese enhed for musen lårben

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...