Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (81772308) en de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (nr. 2017YFA0205502).

Alle methoden waarbij levende dieren werden uitgevoerd overeenkomstig het dier zorg en gebruiken van richtsnoeren voor het zuidoosten Universiteit, China.
1. bereiding van PEI-SPIONs
<ol><li>
Voorbereiding van oliezuur gemodificeerde SPIONs
	<ol>
<li>Los FeCl3•6H2O en FeSO4•7H2O in water onder de bescherming van N2.<ol>
<li>Voeg 28 g FeCl3•6H2O en 20 g FeSO4•7H,2O in 80...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

Macrofagen zijn vuurvast tot transfect door veelgebruikte nonviral benaderingen, zoals electroporation, kationische liposomen, en lipide-soorten. Hier beschreven we een betrouwbare en efficiënte methode om transfect van macrofagen met siRNA. Met behulp van het huidige protocol, kunnen meer dan 90% van macrofaag-achtige RAW 264.7 cellen (figuur 2B) en rat peritoneale macrofagen18 zijn transfected met siRNA zonder aanzienlijke waardevermindering van de levensvatbaarhei...

Macrofagen zijn een soort aangeboren immuun cellen verdeeld in alle weefsels van het lichaam, zij het in verschillende hoeveelheden. Door overlegging van een verscheidenheid van cytokines en andere bemiddelaars, zij een kritische rol spelen in de verdediging van de gastheer tegen invasie microbiële ziekteverwekkers, weefselherstel na verwonding en bij het handhaven van de weefsel homeostase1. Macrofagen zijn vanwege hun belang, voortdurend het onderwerp van intensief onderzoek. Ondanks de prevalentie in genregulatie en functie studies, siRNA-gemedieerde gene zwijgen is echter minder kans om te slagen in macrofagen, omdat deze cellen — met name primaire macrofagen — zijn vaak moeilijk te transfect. Dit kan worden toegeschreven aan een relatief hoge mate van toxiciteit meest gevestigde transfectie benaderingen waarin het celmembraan chemisch is is gekoppeld (bijvoorbeeldmet polymeren en lipiden) of fysiek (bijvoorbeelddoor electroporation en Gene geweren) verstoord te laten siRNA moleculen Kruis het membraan, daardoor drastisch verminderen van2,3van de levensvatbaarheid van de macrofagen. Macrofagen zijn bovendien speciale fagocyten rijk aan afbraakroutes enzymen. Deze enzymen kunnen schade aan de integriteit van siRNA, verzwakken haar silencing efficiëntie zelfs als gen-specifieke siRNA is afgeleverd in de cel3,4. Daarom moet een effectieve macrofaag-gerichte siRNA delivery systeem ter bescherming van de integriteit en stabiliteit van siRNA tijdens levering4.
Het wordt steeds duidelijker dat disfunctionele macrofagen zijn betrokken bij het opzetten en de progressie van bepaalde gemeenschappelijke klinische stoornissen zoals auto-immune ziekten, kanker en atherosclerose. Om deze reden, modulerende macrofaag functie met, bijvoorbeeld, siRNA, is ontstaan als een aantrekkelijke methode voor de behandeling van deze stoornissen5,6,7. Hoewel veel vooruitgang is geboekt, is een grote uitdaging van siRNA gebaseerde behandeling strategie de specificiteit van de arme cel van systemisch toegediende siRNA en de onvoldoende siRNA ICT door macrofagen, die bijgevolg tot ongewenste bijwerkingen leiden. In vergelijking met gratis nucleïnezuur therapeutics die meestal geen optimale cel selectiviteit en leiden vaak tot uit-target bijwerkingen, drug-geladen nanodeeltjes (NPs), vanwege hun spontane neiging van worden gevangen door het reticuloendotheliaal systeem, kan worden ontworpen voor passieve targeting macrofagen in vivo, waardoor verbeterde therapeutische effectiviteit met minimale bijwerkingen8. Huidige NPs onderzocht voor de levering van molecules van RNA omvatten anorganische nanocarriers en verschillende liposomen polymeren9. Onder hen toont polyethyleneimine (PEI), een type van kationische polymeren staat bindend en nucleïnezuren condenserend in gestabiliseerde NPs, de hoogste RNA capaciteit9,10te leveren. PEI nucleïnezuren beschermt tegen aantasting van het enzymatische en nonenzymatic hun overdracht bemiddelt tussen de celmembranen en bevordert hun intracellulaire vrijlating. Hoewel aanvankelijk geïntroduceerd als een DNA levering reagens, PEI bleek later een aantrekkelijk platform voor in vivo siRNA levering, hetzij lokaal of systemisch9,10.
Superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPIONs) hebben aangetoond grote belofte in de medische biologie, vanwege hun magnetische eigenschappen, biocompatibiliteit, vergelijkbare grootte op biologisch belangrijke objecten, hoge oppervlakte-gebied-te-volumeverhouding, en gemakkelijk aan te passen oppervlak voor bioagent bijlage11. Bijvoorbeeld, vanwege hun potentiële nut als contrast agent en snelle opname door macrofagen, zijn SPIONs ontstaan als een favoriete klinische instrument om beeld weefsel macrofagen12. Terwijl de SPIONs zijn ook uitvoerig bestudeerd als nucleïnezuur levering voertuigen11,13,14,15, om onze kennis, bevat de literatuur weinig rapporten van SPIONs als een drager voor macrofaag-gerichte siRNA levering. Voor de levering van het gen door SPIONs, is hun oppervlak meestal bekleed met een laag van hydrofiel kationische polymeren waarop negatief geladen nucleic zuren kunnen worden via een elektrostatisch proces aangetrokken en vastgebonden. Hier presenteren we een methode voor de synthese van SPIONs waarvan oppervlak wordt gewijzigd met laag-moleculair-gewicht (10 kDa), vertakte PEI (PEI-SPIONs). Deze magnetische nanoplatforms zijn dan aangewend om te condenseren siRNA, vorming van PEI-SPION/siRNA complexen waarmee siRNA vervoer in de cel. We reden dat spontane fagocytose van SPIONs door de cellen van de reticuloendotheliaal systeem16, in combinatie met het sterke vermogen van bindende en PEI-SPIONs geschikt voor het efficiënte vervoer van siRNA in condenserend nucleic zuren door PEI, maakt macrofagen. De hier gepresenteerde gegevens ondersteunen de haalbaarheid PEI-SPION/siRNA-gemedieerde gene monddood maken in macrofagen in cultuur, alsmede in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

Vanwege hun cruciale rol bij het reguleren van de immuunrespons, macrofagen hebben voortdurend onderwerp geweest van intensief onderzoek en vertegenwoordigen een veelbelovend therapeutisch doel in vele aandoeningen, zoals kanker, auto-immune ziekten en atherosclerose. RNAi-gemedieerde gene zwijgen is een waardevolle benadering van keuze sonde te manipuleren macrofaag functie; echter de transfectie van macrofagen met siRNA wordt vaak beschouwd als worden technisch uitdagende en paar methodologieën gewijd aan de overdracht van siRNA aan macrofagen zijn momenteel beschikbaar. Hier presenteren we een protocol superparamagnetische ijzeroxide polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes (PEI-SPIONs) te gebruiken als een voertuig voor de beoogde levering van siRNA aan macrofagen. PEI-SPIONs zijn in staat van bindende en volledig condenserend siRNA wanneer de gewichtsverhouding Fe: siRNA 4 bereikt en hoger. In vitro, deze nanodeeltjes kan efficiënt leveren siRNA in primaire macrofagen, alsmede in de macrofaag-achtige RAW 264.7 cellijn, zonder afbreuk te doen aan levensvatbaarheid van de cellen in de optimale dosis voor transfectie, en, uiteindelijk, ze veroorzaken siRNA-gemedieerde doel gene zwijgen. Naast wordt gebruikt voor in vitro siRNA transfectie, vormen PEI-SPIONs ook een veelbelovende instrument voor het leveren van siRNA macrofagen in vivo. Met het oog op de gecombineerde functies van magnetische eigenschap en het gen-zwijgen vermogen, worden systemisch toegediende PEI-SPION/siRNA deeltjes verwacht niet alleen te moduleren macrofaag functie, maar ook om macrofagen image gemaakt en bijgehouden worden. Kortom, PEI-SPIONs een eenvoudige, veilige en effectieve nonviral platform voor siRNA levering aan macrofagen vertegenwoordigen zowel in vitro als in vivo.

De grootte en de zeta potentieel van PEI-SPIONs bereid met dit protocol werden in het bereik van 29-48 nm (polydispersiteit index: 0.12 - 0.23) en 30-48 mV, respectievelijk. Ze waren stabiel in water bij 4 ° C voor meer dan 12 maanden zonder duidelijk aggregatie. Om te beoordelen hun siRNA bindend vermogen, waren PEI-SPIONs gemengd met siRNA op verschillende Fe: siRNA gewicht verhoudingen. Figuur 1 laat zien dat wanneer de gewichtsverhouding Fe: siRNA bereik...

Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Beschrijven we een methode van het gebruik van polyethyleneimine (PEI)-gecoat superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes voor transfecting macrofagen met siRNA. Deze nanodeeltjes kan efficiënt siRNA leveren aan macrofagen in vitro en in vivo en stilte doel genexpressie.

Ijzeroxide Polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes als een voertuig voor de levering van kleine Mengend RNA aan macrofagen In Vitro en In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Deze maatregel kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen. Op het gebied van humanologie. Dat antwoord in de functie van macrofagen onder fysiologische eind aan pathologische voorwaarden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat polyethyleenimine gecoat efficiënt en vitro kan zonder in te leveren op cel. Onder optimale doses. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot therapie en diagnose van vele chronische ontstekingsstoornissen en kankers.Waar macrofagen een essentiële rol spelen bij de pathogenese. Het aantonen van de procedure zal Na Jia zijn. Een afgestudeerde student van mijn lab.En Kaixuan Wang een afgestudeerde student van Dr. Xiaohua's lab. Om 300 gram gemodificeerd superparamagnetic iron oxide nanodeeltjes of SPION's eerst te bereiden voeg 28 gram pharas chloride hexahydraat toe. En 20 gram pharas selfate heptahydraat tot een beker met 80 milliliter gedeïsized water.En gebruik een glazen leiding om stikstof in de oplossing te introduceren. Roeren tot de vaste stof is opgelost. Verwarm het reactiemengsel tot 72 graden Celsius met roeren bij 800 rotaties per minuut.En voeg 40 milliliter van 28% ammoniakwater toe aan het bekerglas. Na vijf minuten voeg negen milliliter van allylic zuur daling verstandig. En houd het mengsel op 72 graden Celsius gedurende drie uur met continu roeren.Aan het einde van de incubatie koel de resulterende oplossing voor kamertemperatuur. En neerslaan het mengsel via magnetische scheiding volgens standaard protocollen. Was vervolgens de SPION met neerslag drie keer met absolute ethylalcohol.En asperse het neerslag in 100 milliliter n-hexaan. Ter voorbereiding van dimercapto acrylzuur gemodificeerde SPION's voeg 800 milligram van de bondgenootzuur gemodificeerde SPION's. Verspreid in 200 milliliter n-hexaan en 400 milligram dimercapto acrylzuur verspreid in 200 milliliter aceton in een driehalskolf in een waterbad bij 60 graden Celsius.Voeg vervolgens 200 microliter triethylamine drop verstandig aan de kolf met roeren op 1000 rotaties per minuut en refluxing. Een zwart neerslag kan worden verkregen door magnetische scheiding na vijf uur. Gebruik vervolgens tetramethylammoniumhydroxide om de pH van de oplossing aan te passen voor homogene dispersie's van de hydrofiele SPION's in gedeïmiseerd water.Gedegenereerde polyethyleeneimine gecoate SPION's voegen de dimercapto acrylzuur gemodificeerde SPION's colloïdale oplossing drop verstandig in een 10 kilodalton polyethyleenimine oplossing. In een 500 milliliter drie hals kolf onder mechanische roeren bij 1000 rotaties per minuut gedurende twee uur. Voeg aan het einde van de incubatie de resulterende oplossing toe aan een ultrafiltratiebuis met een moleculair gewicht van 100 kilodalton en een inhoud van 15 milliliter.Het monster moet worden gebruikt totdat de resterende oplossing een volume van één milliliter bereikt. Voeg gedeïsized water toe aan de oplossing om het volume terug te brengen tot 15 milliliter. En centrafuse en rehydraat de oplossing nog tien keer zoals net aangetoond.Vervolgens filter de oplossing door een 22 micron filter voor opslag op vier graden Celsius. Om de siRNA nanodeeltjes voor te bereiden, voeg je eerst drie microliters vers bereide 20 micromolar siRNA-oplossingen toe aan vijf gelabelde RNA's gratis microcentroafused buizen. En voeg 0, 8, 1.6, 3.2, en 6.4 microgram van polyethyleenimine SPION's toe aan buizen die nul, één, twee, vier, en acht respectievelijk etiketteerden.Na het mengen met zachte pipetting, incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de polyethyleenimine SPION siRNA complexen te vormen. En bereid een drie procent agarose gel met ik zuiverheid agarose. Voeg aan het einde van de incubatie één microliter 6X DNA-laadbuffer per vijf microliter monster aan elke buis toe en meng zorgvuldig.Laad vervolgens alle monsters op de gel. En elektroforese uitvoeren met vijf volt per centimeter. Totdat de bromofenol blauwe kleurstof migreert twee derde van de lengte op de gel.Een dag voorafgaand aan de transfectie wassen een muis microfaag als RAW264.7 cel cultuur met PBS. En behandel de cellen met een milliliter van 25% trypsine gedurende vijf tot tien minuten bij 37 graden Celsius in een vijf procent koolstofdioxide incubator. Wanneer de meerderheid van de cellen zijn losgemaakt.Activeer de trypsine met vijf milliliter complete DMEN. Dan pippete de oplossing meerdere malen om eventuele celclusters te verspreiden. Breng de celsuspensie over naar een steriele conackelbuis van 15 milliliter voor centrifugatie.Dan opnieuw schorsen de cellen in vijf milliliter van verse volledige DMEN voor het tellen. Verdun de cellen tot een 4,5 keer tien tot de vierde cellen per milliliter van volledige DMEN-concentratie. En voeg twee milliliter medium toe aan elke put van een zes putplaat voor een 24-uurs incubatie in de couveuse van de celcultuur.De volgende dag de juiste verhouding van polyethyleenimine SPION siRNA nanodeeltjes in een 1,5 milliliter RNA stream microcentrifuge buis met zachte mengen zoals net aangetoond. En voeg het juiste volume van polyethyleenimine SPION siRNA nanodeeltjes complex aan elke put die is vervangen door een milliliter vers medium. Bereid polyethyleenimine SPION si complexen.in dit geval veel meer maanden polyethyleenimine SPION kan worden gebruikt Dus het minimaliseren van hun potentiële toxiciteit. Draai vervolgens de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de nanodeeltjes over de putbodems te bereiken. Breng de plaat terug naar de celcultuur incubator tot latere cellulaire update of gen knockdown deficiëntie analyse.Polyethyleenimine SPION's met een zeta potentieel van 30,5 en 37 millivolt vertonen geen schijnbare cytotoxiciteit bij concentraties tot 30 microgram ijzer per milliliter. Dat is ongeveer twee keer huren dan de concentratie die normaal wordt gebruikt voor celtransfectie. Polyethyleenimine SPION's zeta potentieel van 48 millivolt zijn echter giftig.Zelfs bij de laagste onderzochte dosis. Zoals geanalyseerd door flow cytometrie, meer dan 90% van de cellen kunnen worden doorgesneden met fluorescerend gelabeld polyethyleen SPION siRNA complexen op 15 microgram ijzer per milliliter. Beoordeling van de effecten van polyethyleenimine SPION siRNA concentraties op cellulaire internalisatie door het verpletteren van blauwe vlekken blijkt minimaal detecteerbare vlekken op 7,5 microgram ijzer per milliliter.Maar duidelijk zichtbare vlekken op 15 microgram ijzer per milliliter die niet toenemen bij hogere concentraties ijzer waarschijnlijk als gevolg van polyethyleenimine SPION siRNA opname verzadiging. Peritoneale macrofagen die zijn verwisseld met polyethyleenimine SPION's herbergen specifieke siRNA vertonen een aanzienlijke daling van de targe mRNA niveaus in vergelijking met niet-specifieke siRNA. Wat suggereert dat siRNA kan ontsnappen uit endocytische vlokjes in het cytoplasma om de RNA interferentie machines te bereiken.Verder na intraveneuze injectie van een enkele dosis polyethyleenimine SPION siRNA nanodeelicle complexen flocentimetrische analyse van CD11b positieve en CD3 positieve cellen blijkt een efficiëntere opname van de nanodeeltjes door CD11b uitdrukken macrofagen dan door CD3 positieve cellen op elk moment punt in alle van de onderzochte organen. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de polyethyleenimine SPION's voor te bereiden met een gemiddeld datapotentieel dat niet hoger is dan 37 millivolt en om de polyethyleenimine SPION siRNA-complexen op de lage ijzer-tot siRNA-ratio's voor te bereiden. Deze techniek vergelijkt de noodzaak voor onderzoekers om therapeutisch potentieel van het richten van macrofaag in dierlijke motoren van menselijke ziekten zoals en kanker te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Een strategie om de Novo Mutaties Leg in voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Slow-release Drug Delivery via Elvax 40W aan de Rat Retina: Implicaties voor de behandeling van chronische voorwaarden

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Isoleren en het gebruik van de afdelingen van Bovine mesenterica en Vein als Bioassay om te testen voor vasoactiviteit in de dunne darm

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intra-uteriene Telemetrie naar Mouse Contractiele druk te meten<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluatie van de fractuur Callus ontwikkeling tijdens het bot genezing in muizen met behulp van een MRI-compatibele osteosynthese apparaat voor de muis dijbeen

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Een klinisch onderzoek waarin de veiligheid, werkzaamheid en levering van op olijfolie gebaseerde drie kamer zakken voor parenterale voeding worden geëvalueerd