Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81772308) ואת המחקר הלאומי מפתח תוכנית הפיתוח של סין (מספר 2017YFA0205502).

כל השיטות מעורבים בעלי חיים בוצעו על פי החיה רבה ושימוש להנחיות של אוניברסיטת דרום-מזרח, סין.
1. הכנת פיי-SPIONs
<ol><li>
הכנת SPIONs חומצה אולאית-השתנה
	<ol>
<li>להמיס FeCl3•6H2O ו מכל4•7H2O במים תחת ההגנה של N2.<ol>
<li>להוסיף 28 גרם של FeCl3•6H2O ו- 20 ג?...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

המקרופאגים הם דברים מעוותים transfect על ידי גישות nonviral בשימוש נפוץ, כגון אלקטרופורציה, ליפוזומים cationic השומנים מינים. כאן אנחנו תיאר שיטה אמינה ויעילה כדי transfect מקרופאגים עם siRNA. משתמש בפרוטוקול הנוכחי, מעל 90% של תאים 264.7 גלם כמו מקרופאג (איור 2B) ו מקרופאגים הצפק החולדה18...

המקרופאגים הם סוג של תאים חיסוניים מולדת מופץ בכל רקמות הגוף, אם כי בכמויות שונות. על ידי ייצור מגוון רחב של ציטוקינים ומתווכים, הם ממלאים תפקידים חיוניים ההגנה מארח נגד הפולשים חיידקים פתוגנים, תיקון רקמות בעקבות פגיעה, בשמירה על הומאוסטזיס הרקמה1. בשל חשיבותם, מקרופאגים ברציפות כבר הנושא של מחקר אינטנסיבי. עם זאת, למרות השכיחות שלה הכונה ולימודים פונקציה, בתיווך siRNA ג'ין להחרשת סביר פחות להצליח מקרופאגים כי תאים אלה — במיוחד, מקרופאגים הראשי — הם לעתים קרובות קשה transfect. זה יכול להיות מיוחסות רמה גבוהה יחסית של רעילות הקשורים ביותר ומבוססת תקנים גישות שבו הוא קרום התא מבחינה כימית (למשל, עם פולימרים ושומנים) או פיזית (למשל, על ידי אלקטרופורציה ו ג'ין רובים) משובשות לתת מולקולות siRNA חוצה הממברנה, ובכך באופן דרסטי הפחתת של מקרופאגים הכדאיות2,3. יתר על כן, המקרופאגים הם עשירים degradative אנזימים ייעודי phagocytes. אנזימים אלה יכול להזיק לתקינות של siRNA, היחלשות ביעילותה שתיקה גם אם גנים ספציפיים siRNA נמסרה לתוך התא3,4. לכן, מערכת משלוח siRNA ממוקדות מקרופאג יעיל צריך להגן את תקינות והיציבות של siRNA במהלך משלוח4.
זה ברור יותר ויותר כי מקרופאגים לקוי הם מעורבים החניכה, התקדמות של הפרעות מסוימות קליניים נפוצים כמו מחלות אוטואימוניות, טרשת עורקים, סרטן. מסיבה זו, להתכוונן מקרופאג פונקציה עם, למשל, siRNA, יש כבר מתעוררים כמו מתודולוגיה אטרקטיבי לטיפול אלה הפרעות5,6,7. למרות התקדמות רבה נעשתה, האתגר העיקרי של הטיפול מבוססת siRNA האסטרטגיה היא יחודיות תא המסכן של siRNA מערכתית בניהול, תפיסה siRNA לא מספיקות על ידי מקרופאגים, אשר כתוצאה מכך להוביל לתופעות לוואי לא רצויות. לעומת הרפוי חומצת גרעין חינם בדרך כלל חוסר תא אופטימלית סלקטיביות, לעיתים קרובות להוביל תופעות לוואי, טעון-סמים חלקיקים (NPs), בשל שלהם נטיה ספונטנית של בשבי על ידי מערכת reticuloendothelial, את המטרה . ניתן לתכנן עבור מיקוד פסיבי מקרופאגים ויוו, המאפשר שיפור יעילות טיפולית עם תופעות לוואי מינימליות8 NPs הנוכחי חקר למסירה של מולקולות RNA כוללים nanocarriers אורגניים, ליפוזומים שונים פולימרים9. ביניהם, polyethyleneimine (פיי), סוג של יכולת של איגוד וכן עיבוי חומצות גרעין לתוך NPs מיוצב, cationic פולימרים מציג את הרנ א הגבוהה אספקת קיבולת9,10. פיי מגן חומצות גרעין השפלה אנזימטיות, nonenzymatic, ומתווך העברה שלהם על פני קרום התא, ומקדם שחרורם תאיים. אמנם בתחילה הציג ריאגנט משלוח ה-DNA, פיי הודגם לאחר מכן להיות פלטפורמה מושכת ויוו siRNA משלוח, או באופן מקומי או מערכתית9,10.
חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIONs) הראו הבטחה גדולה וההתערבות, בשל שלהם תכונות מגנטיות, כימי, גודל דומה אובייקטים חשובים מבחינה ביולוגית, יחס פני-שטח-כדי-נפח גבוה, וניתנת להתאמה בקלות השטח עבור הקובץ המצורף גורם המחלה. אלים11. למשל, בשל פוטנציאל ניגוד הסוכן, ספיגה מהירה על ידי מקרופאגים, SPIONs הופיעו ככלי קליני האהוב תמונה רקמה מקרופאגים12. בעוד SPIONs גם נחקרו בהרחבה חומצת גרעין משלוח רכב11,13,14,15, לידע שלנו, הספרות מכיל כמה דיווחים SPIONs כנשא של משלוח, ממוקדות מקרופאג siRNA. למסירה גן מאת SPIONs, פני השטח שלהם בדרך כלל מצופה בשכבה של פולימרים cationic הידרופילית שעליו חומצות גרעין טעונים שלילית יכול להיות electrostatically נמשכת ולא קשורה. כאן, אנו מציגים את שיטת סינתזה SPIONs של מי פני השטח משתנה עם נמוך משקל מולקולרי (10 kDa), מסועף פיי (פיי-SPIONs). אלה nanoplatforms מגנטי מועסקים ואז לתמצת siRNA, הקמת מתחמי פיי-SPION/siRNA המאפשרים תחבורה siRNA לתוך התא. אנחנו הסיבה הזאת phagocytosis ספונטנית של SPIONs על ידי תאים המערכת reticuloendothelial16, בשילוב עם יכולת חזקה של האיגוד, עיבוי חומצות גרעין על ידי פיי, למתאימה פיי-SPIONs תעבורה יעילה של siRNA לתוך מקרופאגים. הנתונים המוצגים כאן לתמוך את הכדאיות של פיי-SPION/siRNA-מתווכת ג'ין להחרשת ב מקרופאגים תרבות וכן ויוו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

בגלל תפקידם קריטי בוויסות תגובות חיסוניות, מקרופאגים ברציפות כבר הנושא של מחקר אינטנסיבי ומייצגות מטרה טיפולית מבטיחה בהפרעות רבות, כגון מחלות אוטואימוניות, טרשת עורקים, סרטן. מציאה RNAi בתיווך ג'ין להחרשת היא גישה יקר של בחירה כדי לחקור ולטפל מקרופאג פונקציה; עם זאת, תרביות תאים של מקרופאגים עם siRNA נחשב לעתים קרובות להיות מאתגר מבחינה טכנית,, בזמן הנוכחי, כמה מתודולוגיות המוקדש את העברת siRNA מקרופאגים הינם זמינים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול של שימוש חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה polyethyleneimine פאראמגנטי (פיי-SPIONs) כרכב למסירה יישוב של siRNA מקרופאגים. פיי-SPIONs מסוגלים של האיגוד לבין לחלוטין עיבוי siRNA כאשר היחס בין משקל Fe: siRNA מגיע 4 ומעלה. במבחנה, חלקיקים אלה יכול ביעילות לספק siRNA לתוך מקרופאגים הראשי, כמו גם לתוך הקו תא 264.7 גלם כמו macrophage, מבלי להתפשר על הכדאיות תא למינון האופטימלי עבור תרביות תאים, ו, בסופו של דבר, הם זירוז היעד בתיווך siRNA ג'ין להחרשת. מלבד בשימוש עבור במבחנה siRNA תרביות תאים, פיי-SPIONs הם גם כלי מבטיח להעברת siRNA מקרופאגים ויוו. לאור התכונות שלו משולב של המאפיין מגנטי ויכולת ג'ין להחרשת, חלקיקים פיי-SPION/siRNA מערכתית בניהול צפויים לא רק כדי לווסת את הפונקציה macrophage, אלא גם כדי לאפשר מקרופאגים עם תמונה ולהיות במעקב. בעיקרו של דבר, פיי-SPIONs מייצגים פלטפורמה nonviral פשוט, בטוח ויעיל למסירה siRNA המקרופאגים גם במבחנה וגם בתוך vivo.

זטא וגודל הפוטנציאל של פיי-SPIONs מוכן עם פרוטוקול זה היו בטווח של 29-48 nm (אינדקס polydispersity: 0.12 - 0.23) ו- 30-48 mV, בהתאמה. הם היו יציבים במים ב 4 ° C מעל 12 חודשים ללא צבירת ברור. כדי להעריך שלהם siRNA היכולת מחייב, פיי-SPIONs היו מעורבים עם siRNA-Fe: siRNA שונים פרופורציה. איור 1 מראה כי ...

Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

אנו מתארים שיטה של שימוש polyethyleneimine (פיי)-מצופה חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי עבור מקרופאגים transfecting עם siRNA. חלקיקים אלה יכולים להעביר ביעילות siRNA מקרופאגים במבחנה , ויוו , שתיקה ביטוי גנים היעד.

חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה Polyethyleneimine כרכב למסירה של RNA מפריעות קטן כדי מקרופאגים במבחנה , In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

אמצעי זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח. בתחום ההומניולוגיה. תשובה זו בתפקוד המקרופאגים בקצה הפיזיולוגי של התנאים הפתולוגיים.היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי פוליאתילנימין מצופה יכול ביעילות להלהים במבחנה מבלי להתפשר על התא. תחת מינונים אופטימליים. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת טיפול ואבחון של הפרעות דלקתיות כרוניות רבות וסרטן.כאשר מקרופאגים ממלאים תפקיד חיוני בפתוגנזה. הדגמת ההליך תהיה נה ג'יה. סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.וקאיקסואן וואנג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה של ד"ר שיאוהואה. כדי להכין חומצה אלילית שונה סופר paramagnetic תחמוצת ברזל חלקיקים או SPION הראשון להוסיף 28 גרם של פרעה כלוריד hexahydrate. ו -20 גרם פרעה עצמית heptahydrate לסק המכיל 80 מיליליטר של מים deionized.ולהשתמש בצינור זכוכית כדי להכניס חנקן לפתרון. תוך ערבוב עד שהעניין המוצק יתמוסס. מחממים את תערובת התגובה ל-72 מעלות צלזיוס תוך ערבוב של 800 סיבובים בדקה.ומוסיפים 40 מיליליטר של 28% מי אמוניה לבקבוק. לאחר חמש דקות להוסיף תשעה מיליליטר של חומצה אלילית טיפה חכם. ולשמור על התערובת ב 72 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות עם ערבוב מתמשך.בסוף הדגירה מקררים את הפתרון שנוצר לטמפרטורת החדר. ולזרז את התערובת באמצעות הפרדה מגנטית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר מכן לשטוף את SPION המכיל לזרז שלוש פעמים עם אלכוהול אתיל מוחלט.ולזרז את המשקעים ב-100 מיליליטר של נ-הקסאן. כדי להכין חומצה אקרילית dimercapto שונה SPION של להוסיף 800 מיליגרם של חומצה ברית שונה SPION של. התפזר ב 200 מיליליטר של n-hexane ו 400 מיליגרם של חומצה אקרילית dimercapto מפוזרים 200 מיליליטר של אצטון לתוך בקבוק שלושה צוואר באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס.הבא להוסיף 200 microliters של טריאתילאמין טיפה חכם לבקבוק עם ערבוב ב 1000 סיבובים לדקה refluxing. משקעים שחורים ניתן להשיג על ידי הפרדה מגנטית לאחר חמש שעות. לאחר מכן השתמש tetramethylammonium הידרוקסיד כדי להתאים את ה- pH של הפתרון לפיזור הומוגני של SPION הידרופילי במים deionized.מנוון פוליאתילנימין מצופה SPION של להוסיף את החומצה האקרילית dimercapto שונה הפתרון הקולואידי של SPION טיפה חכם לתוך 10 פתרון פוליאתילנימין קילודלטון. בבקבוק צוואר 500 מיליליטר תחת ערבוב מכני ב 1000 סיבובים לדקה במשך שעתיים. בסוף הדגירה להוסיף את הפתרון וכתוצאה מכך צינור סינון אולטרה עם משקל מולקולרי מנותק של 100 קילודלטון ותוכן של 15 מיליליטר.Centrafuse המדגם עד הפתרון הנותר מגיע נפח מיליליטר אחד. הוסף מים deionized לפתרון כדי להחזיר את עוצמת הקול ל 15 מיליליטר. ו centrafuse ולייבש מחדש את הפתרון עשר פעמים נוספות כפי שהוכח רק.לאחר מכן לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 22 מיקרון לאחסון בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את חלקיקי siRNA תחילה להוסיף שלושה microliters של פתרונות siRNA מיקרומולר מוכן טרי לחמישה צינורות microcentroafused חינם של RNA שכותרתו. ותוסיף 0, 8, 1.6, 3.2 ו-6.4 מיקרוגרם של פוליאתילנימין SPION לצינורות המסוגנים כאפס, אחד, שניים, ארבעה ושמונה בהתאמה.לאחר ערבוב עם צינורות עדינים, הדגירה את הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את מתחמי SIRNA SPION פוליאתילנימין להיווצר. ולהכין ג'ל אגרוז שלושה אחוזים עם אני טוהר אגרוז. בסוף הדגירה מוסיפים מיקרוליטר אחד של מאגר טעינת דנ"א 6X לכל חמישה מיקרוליטרים של דגימה לכל צינור ומערבבים בזהירות.ואז לטעון את כל הדגימות על הג'ל. ולהפעיל אלקטרופורזה בחמישה וולט לסנטימטר. עד שהצבע הכחול ברומופרנול נודד שני שליש מהאורך על הג'ל.יום אחד לפני transfection לשטוף microphage העכבר כמו RAW264.7 תא תרבות עם PBS. ולטפל בתאים עם מיליליטר אחד של 25% טריפסין במשך חמש עד עשר דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני חמישה אחוזים. כאשר רוב התאים התנתקו.השבת את טריפסין עם חמישה מיליליטר של DMEN מלא. לאחר מכן pippete הפתרון מספר פעמים כדי לפזר את כל אשכולות התא. העבר את ההשעיה התא לצינור קונקל סטרילי 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה.ואז להשעות מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של DMEN שלם טרי לספירה. לדלל את התאים ל 4.5 פעמים עשר לתאים הרביעיים למיליליטר של ריכוז DMEN מלא. ולהוסיף שני מיליליטר של בינוני לכל באר של צלחת שש באר עבור אינקובציה 24 שעות ביממה באינקובטור תרבות התא.למחרת להכין את היחס המתאים של פוליאתילנימין SPION siRNA חלקיקים ב 1.5 מיליליטר זרם RNA מיקרוצנטריפוגה צינור עם ערבוב עדין כפי שהודגם רק. ולהוסיף את הנפח המתאים של פוליאתילנימין SPION siRNA קומפלקס חלקיקים לכל באר אשר הוחלף עם מיליליטר אחד של מדיום טרי. הכינו מתחמי פוליאתילנימין SPION si.במקרה זה חודשים רבים יותר של פוליאתילנימין SPION ניתן להשתמש ובכך למזער את הרעילות הפוטנציאלית שלהם. ואז מערבל את הצלחת בזהירות כדי להשיג חלוקה אחידה של הננו-חלקיקים על פני תחתיות הבאר. להחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא עד עדכון הסלולר הבאים או ניתוח חוסר נפילה גנים.פוליאתילנימין SPION של עם פוטנציאל זטה של 30.5 ו 37 מילי-וולט אינם מפגינים רעילות ציטו לכאורה בריכוזים של עד 30 מיקרוגרם של ברזל למיליליטר. וזה בערך פי שניים לשכור מאשר הריכוז משמש בדרך כלל עבור transfection התא. פוטנציאל הזטה של פוליאתילנימין SPION של 48 מילי-וולט עם זאת הם רעילים.אפילו במינון הנמוך ביותר שנבדק. כפי שנותח על ידי ציטומטריית זרימה, יותר מ 90% של תאים ניתן לשנות עם פלואורסצנטי שכותרתו פוליאתילנימין SPION siRNA קומפלקסים ב 15 מיקרוגרם של ברזל למיליליטר. הערכה של ההשפעות של ריכוזי SIRNA פוליאתילניאמין SPION על הפנמה הסלולר על ידי ריסוק כתמים כחולים מגלה כתמים מינימליים לזיהוי ב 7.5 מיקרוגרם של ברזל למיליליטר.אבל כתמים גלויים בבירור ב 15 מיקרוגרם של ברזל למיליליטר כי אינם גדלים בריכוזים גבוהים יותר של ברזל סביר בשל פוליאתילנימין SPION siRNA ספיגת רוויה. מקרופאגים הצפקים עם ה-siRNA הספציפי של פוליאתילנימין SPION מציגים ירידה משמעותית ברמות ה-mRNA של targe בהשוואה ל-siRNA לא ספציפי. מציע כי siRNA יכול לברוח שלפוחיות אנדוציטיות לתוך הציטופלסמה כדי להגיע למכונות הפרעה RNA.עוד יותר לאחר הזרקה תוך ורידי של מנה אחת של פוליאתילנימין SPION siRNA קומפלקסים חלקיקים flocentimetrical ניתוח של CD11b חיובי CD3 תאים חיוביים מגלה ספיגה יעילה יותר של חלקיקים על ידי CD11b הבעת מקרופאגים מאשר על ידי CD3 תאים חיוביים בכל נקודת זמן בכל האיברים שנבדקו. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להכין את פוליאתילנימין SPION של עם פוטנציאל נתונים ממוצע לא גבוה מ 37 מיליבולטים ולהכין את מתחמי SIRNA פוליאתילנימין SPION על יחס ברזל נמוך siRNA. טכניקה זו משווה את הצורך של חוקרים לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של מיקוד מקרופאג ' במנועים מן החי של מחלות אנושיות כגון וסרטן.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

משלוח שחרור איטי תרופות דרך Elvax 40W לרשתית העכברוש: ​​השלכות לטיפול במצבים כרוניים

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

בידוד ושימוש בסעיפים של עורקי שור mesenteric ווריד כמבדק לבדיקת Vasoactivity במעי הדק

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

טלמטריה תוך רחמי למדידת לחץ עכבר התכווצות<em&gt; In vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

אין ויוו הערכה של שבר פיתוח קסם במהלך עצם הריפוי בעכברים שימוש בהתקן התואם ל- MRI Osteosynthesis את העכבר אתי

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...