Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

इस काम को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (८१७७२३०८) और चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (No. 2017YFA0205502) ने समर्थन दिया था ।

सभी जीवित पशुओं को शामिल तरीकों के अनुसार पशु देखभाल और दक्षिण पूर्व विश्वविद्यालय, चीन के उपयोग के दिशा निर्देशों के साथ प्रदर्शन किया गया ।
1. पी-SPIONs की तैयारी
<ol><li>
ओलिक अम्ल-संशोधित SPIONs की ?...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

मैक्रोफेज electroporation, cationic liposomes, और लिपिड प्रजातियों के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया वायरल दृष्टिकोण, द्वारा transfect करने के लिए दुर्दम्य हैं । यहां हम सिरना के साथ मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल ...

मैक्रोफेज शरीर के सभी ऊतकों में वितरित जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक प्रकार है, हालांकि अलग मात्रा में । साइटोकिंस और अन्य मध्यस्थों की एक किस्म का उत्पादन करके, वे चोट के बाद ऊतक मरम्मत में माइक्रोबियल रोगजनकों पर हमला करने के खिलाफ मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और ऊतक homeostasis1बनाए रखने में । इनके महत्व के कारण मैक्रोफेज लगातार गहन शोध का विषय रहा है. हालांकि, जीन विनियमन और समारोह के अध्ययन में अपनी व्यापकता के बावजूद, सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने कम मैक्रोफेज में सफल होने की संभावना है क्योंकि इन कोशिकाओं को विशेष रूप से, प्राथमिक मैक्रोफेज-अक्सर transfect मुश्किल है । यह सबसे अच्छी तरह से स्थापित अभिकर्मक दृष्टिकोण जिसमें कोशिका झिल्ली रासायनिक है के साथ जुड़े विषाक्तता के एक अपेक्षाकृत उच्च डिग्री करने के लिए जिंमेदार माना जा सकता है (जैसे, पॉलिमर और लिपिड के साथ) या शारीरिक रूप से (जैसे, electroporation द्वारा और जीन बंदूकें) दो सिरना अणुओं झिल्ली को पार करने के लिए बाधित है, जिससे काफी ' मैक्रोफेज व्यवहार्यता को कम करने2,3। इसके अलावा, मैक्रोफेज degradative एंजाइमों में अमीर फ़ैगोसाइट समर्पित कर रहे हैं । इन एंजाइमों सिरना की अखंडता को नुकसान पहुंचा सकते हैं, भले ही जीन विशिष्ट सिरना सेल3,4में दिया गया है अपनी मुंह बंद करने दक्षता कमजोर । इसलिए, एक प्रभावी मैक्रोफेज-लक्षित सिरना वितरण प्रणाली अखंडता और सिरना की स्थिरता की रक्षा के लिए4प्रसव के दौरान की जरूरत है ।
यह तेजी से स्पष्ट है कि बेकार मैक्रोफेज दीक्षा और स्व-प्रतिरक्षित रोग, atherosclerosis, और कैंसर जैसे कुछ आम नैदानिक विकारों की प्रगति में फंसा रहे हैं । इस कारण के लिए, के साथ मैक्रोफेज समारोह मॉडुलन, उदाहरण के लिए, सिरना, इन विकारों के इलाज के लिए एक आकर्षक पद्धति के रूप में उभर रहा है5,6,7. हालांकि बहुत प्रगति की गई है, सिरना के एक प्रमुख चुनौती आधारित उपचार रणनीति प्रणालीबद्ध प्रशासित सिरना के गरीब कोशिका विशिष्टता और मैक्रोफेज द्वारा अपर्याप्त सिरना है, जो फलस्वरूप अवांछित दुष्प्रभावों के लिए नेतृत्व । नि: शुल्क न्यूक्लिक एसिड चिकित्सकीय है कि आमतौर पर इष्टतम सेल selectivity कमी और अक्सर बंद लक्ष्य को प्रतिकूल प्रभाव, दवा भरी नैनोकणों (एनपीए) का नेतृत्व के साथ तुलना में, उनके सहज प्रवृत्ति के कारण reticuloendothelial प्रणाली द्वारा कब्जा किया जा रहा है, निष्क्रिय लक्ष्यीकरण के लिए vivo मेंमैक्रोफेज करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, न्यूनतम साइड इफेक्ट8के साथ बेहतर चिकित्सकीय प्रभावकारिता के लिए अनुमति देता है. मौजूदा एनपीएस आरएनए अणुओं के वितरण के लिए अन्वेषण अकार्बनिक nanocarriers, विभिन्न liposomes, और पॉलिमर9शामिल हैं । उनमें से, polyethyleneimine (पी), स्थिर एनपीएस में न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी और संघनित्र में सक्षम cationic पॉलिमर का एक प्रकार, उच्चतम आरएनए देने क्षमता9,10से पता चलता है । पी एंजाइमी और nonenzymatic गिरावट से न्यूक्लिक एसिड की रक्षा करता है, कोशिका झिल्ली के पार उनके स्थानांतरण मध्यस्थता, और उनके intracellular रिलीज को बढ़ावा देता है । हालांकि शुरू में एक डीएनए प्रसव के एजेंट के रूप में पेश किया, पी बाद में vivo सिरना वितरण, या तो स्थानीय या प्रणालीबद्ध9,10में के लिए एक आकर्षक मंच हो प्रदर्शन किया था ।
Superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (SPIONs) जैव चिकित्सा में महान वादा दिखाया है, उनके चुंबकीय गुणों के कारण, जैविक रूप से महत्वपूर्ण वस्तुओं के लिए तुलनीय आकार, उच्च सतह क्षेत्र-मात्रा अनुपात, और आसानी से अनुकूलनीय सतह के लिए-एजेंट अनुलग्नक11। उदाहरण के लिए, एक विपरीत एजेंट और मैक्रोफेज द्वारा तेजी से तेज के रूप में अपने संभावित उपयोगिता की वजह से, SPIONs12मैक्रोफेज छवि ऊतक के लिए एक पसंदीदा नैदानिक उपकरण के रूप में उभरा है । जबकि SPIONs भी बड़े पैमाने पर न्यूक्लिक एसिड डिलीवरीवाहनों11,13,14,15के रूप में अध्ययन किया गया है, हमारे ज्ञान के लिए, साहित्य के लिए एक वाहक के रूप में SPIONs के कुछ रिपोर्टों में शामिल मैक्रोफेज-लक्षित सिरना वितरण । SPIONs द्वारा जीन वितरण के लिए, उनकी सतह आमतौर पर हाइड्रोफिलिक cationic पॉलिमर की एक परत है जिस पर नकारात्मक न्यूक्लिक एसिड का आरोप लगाया electrostatically आकर्षित किया जा सकता है और सीमित के साथ लेपित है । यहां, हम synthesizing SPIONs के लिए एक तरीका है जिसकी सतह कम आणविक वजन (10 केडीए), बंटी पी (पी-SPIONs) के साथ संशोधित किया गया है प्रस्तुत करते हैं । इन चुंबकीय nanoplatforms तो गाढ़ा सिरना करने के लिए कार्यरत हैं, बनाने बेई-SPION/सिरना परिसरों कि सेल में सिरना परिवहन सक्षम करें । हम reticuloendothelial प्रणाली16की कोशिकाओं द्वारा SPIONs की है कि सहज phagocytosis कारण, बेई द्वारा बाध्यकारी और संघनित्र न्यूक्लिक एसिड की मजबूत क्षमता के साथ युग्मित, SPIONs के कुशल परिवहन के लिए पी-सिरना उपयुक्त renders Macrophages. यहां प्रस्तुत आंकड़ों में मैक्रोफेज में पी-SPION/सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने की व्यवहार्यता के साथ-साथ vivoमें संस्कृति का समर्थन है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका की वजह से, मैक्रोफेज लगातार गहन अनुसंधान का विषय रहा है और ऐसे स्व-प्रतिरक्षित रोग, atherosclerosis, और कैंसर के रूप में कई विकारों में एक होनहार चिकित्सकीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । RNAi-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने चुनाव की जांच करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है और मैक्रोफेज समारोह में हेरफेर; हालांकि, सिरना के साथ मैक्रोफेज के अभिकर्मक अक्सर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण माना जाता है, और, वर्तमान में, कुछ के तरीके मैक्रोफेज को सिरना हस्तांतरण के लिए समर्पित उपलब्ध हैं । यहां, हम सिरना के लिए मैक्रोफेज के लक्षित वितरण के लिए एक वाहन के रूप में polyethyleneimine लेपित superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (पी-SPIONs) का उपयोग करने का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । पी-SPIONs बाध्यकारी और पूरी तरह से संघनित्र सिरना जब Fe: सिरना वजन अनुपात 4 और ऊपर तक पहुंच में सक्षम हैं । इन विट्रो में, इन नैनोकणों कुशलतापूर्वक प्राथमिक मैक्रोफेज में सिरना उद्धार कर सकते हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में मैक्रोफेज-कच्चे २६४.७ सेल लाइन की तरह, अभिकर्मक के लिए इष्टतम खुराक पर सेल व्यवहार्यता समझौता किए बिना, और, अंततः, वे प्रेरित सिरना-मध्यस्थता लक्ष्य जीन मुंह बंद करने. इसके अलावा इन विट्रो में के लिए इस्तेमाल किया जा रहा सिरना अभिकर्मक, पी-SPIONs भी vivo मेंमैक्रोफेज करने के लिए सिरना पहुंचाने के लिए एक आशाजनक उपकरण हैं । चुंबकीय संपदा और जीन-मुंह बंद करने क्षमता की अपनी संयुक्त सुविधाओं को ध्यान में रखते हुए, प्रणालीबद्ध प्रशासित पी-SPION/सिरना कणों की अपेक्षा की जाती है न केवल मैक्रोफेज समारोह का नियमन करने के लिए बल्कि मैक्रोफेज को भी सक्षम करने के लिए imaged और ट्रैक किया जा सकता है । संक्षेप में, पी-SPIONs सिरना वितरण के लिए एक सरल, सुरक्षित, और प्रभावी गैर वायरल मंच का प्रतिनिधित्व दोनों विट्रो में और vivo मेंमैक्रोफेज ।

आकार और इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार पी-SPIONs के जीटा क्षमता 29-48 एनएम (polydispersity सूचकांक: ०.१२-०.२३) और 30-48 एमवी, क्रमशः की सीमा में थे । वे स्पष्ट एकत्रीकरण के बिना 12 महीने से अधिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ?...

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Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

हम मैक्रोफेज के साथ transfecting सिरना के लिए polyethyleneimine (पी)-लेपित superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन । इन नैनोकणों को कुशलतापूर्वक सिरना में मैक्रोफेज करने के लिए और vivo और मौन लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति में उद्धार कर सकते हैं ।

Polyethyleneimine-लेपित आयरन ऑक्साइड छोटे हस्तक्षेप आरएनए के वितरण के लिए एक वाहन के रूप में नैनोकणों में और Vivo में मैक्रोफेज

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

इस उपाय से महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है । मानव विज्ञान के क्षेत्र में। यह पैथोलॉजिकल स्थितियों के लिए शारीरिक अंत के तहत मैक्रोफेज के कार्य में उत्तर देता है।इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि पॉलीथीलीनीमाइन लेपित सेल से समझौता किए बिना कुशलतापूर्वक विट्रो कर सकते हैं। इष्टतम खुराक के तहत। इस तकनीक के निहितार्थ चिकित्सा और कई पुराने भड़काऊ विकारों और कैंसर के निदान की ओर विस्तार ।जहां मैक्रोफेज रोगजनकों में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन ना जिया होगा । मेरी लैब से ग्रेजुएट स्टूडेंट ।और कैक्सुआन वांग डॉ जियाओहुआ की लैब से ग्रेजुएट स्टूडेंट हैं । एलिलिक एसिड संशोधित सुपर पैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोकणों या स्पीन के पहले 28 ग्राम फाइरस क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट को तैयार करने के लिए। और 20 ग्राम फारस एक बीकर को हेप्टाहाइड्रेट को स्वेट करें जिसमें 80 मिलीलीटर डिएकोनाइज्ड पानी होता है।और समाधान में नाइट्रोजन पेश करने के लिए एक ग्लास नाली का उपयोग करें। जब तक ठोस मामला भंग नहीं हो जाता तब तक सरगर्मी। प्रति मिनट 800 घूर्णन पर सरगर्मी के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण को 72 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।और बीकर में 28% अमोनिया पानी के 40 मिलीलीटर जोड़ें। पांच मिनट के बाद सहयोगी एसिड ड्रॉप वार के नौ मिलीलीटर जोड़ें। और लगातार सरगर्मी के साथ तीन घंटे के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण बनाए रखें ।इनक्यूबेशन के अंत में कमरे के तापमान के परिणामस्वरूप समाधान ठंडा करें। और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार चुंबकीय पृथक्करण के माध्यम से मिश्रण को तेज़ करें। फिर पूर्ण एथिल अल्कोहल के साथ तीन बार वर्षा युक्त स्पीशन को धोएं।और एन-हेक्सान के 100 मिलीलीटर में तेज़ होता है। डिमरकैप्टो एक्रेलिक एसिड संशोधित स्पियोन के ऐड 800 मिलीग्राम तैयार करने के लिए एलिलिक एसिड संशोधित स्पीयन का जोड़ा गया है। एन-हेक्साने के २०० मिलीलीटर और ४०० मिलीग्राम डिमरकैप्टो ऐक्रेलिक एसिड में फैले २०० मिलीलीटर एसीटोन में ६० डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में तीन गर्दन फ्लास्क में फैलाया गया ।इसके बाद 1000 घूर्णन प्रति मिनट और रिफ्लक्सिंग पर सरगर्मी के साथ फ्लास्क में ट्राइथाइलमाइन ड्रॉप वार के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच घंटे के बाद चुंबकीय पृथक्करण द्वारा एक काला वर्षा प्राप्त की जा सकती है। फिर डिओनाइज्ड पानी में हाइड्रोफिलिक स्पीयन के समरूप फैलाव के लिए समाधान के पीएच को समायोजित करने के लिए टेट्रामेथाइलम्मोनियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग करें।पतित पॉलीथीलीनीमाइन लेपित स्पीयन ने डिमरकैप्टो ऐक्रेलिक एसिड संशोधित स्पियोन के कोलाइडियल समाधान को 10 किलोडलटन पॉलीथीलीनीमाइन समाधान में छोड़ दिया। एक ५०० मिलीलीटर तीन गर्दन फ्लास्क में यांत्रिक सरगर्मी के तहत १००० प्रति मिनट दो घंटे के लिए घूर्णन । इनक्यूबेशन के अंत में एक अल्ट्रा छानने का समाधान जोड़ने के साथ एक आणविक वजन 100 किलोdaltons और 15 मिलीलीटर की सामग्री में कटौती।शेष समाधान एक मिलीलीटर मात्रा तक पहुंचने तक नमूना को सेंट्राफ्यूज करें। वॉल्यूम को 15 मिलीलीटर में वापस लाने के लिए समाधान में डिएकोनाइज्ड पानी जोड़ें। और केंद्रीकरण और समाधान दस और बार के रूप में सिर्फ प्रदर्शन रिहाइड्रेट ।फिर चार डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए एक 22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फिल्टर। सिरना नैनोकणों को तैयार करने के लिए पहले पांच लेबल आरएनए के मुफ्त माइक्रोसेंट्रोफस ट्यूबों में नए सिरे से तैयार 20 माइक्रोमोलर सिरना समाधानों के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें। और क्रमशः शून्य, एक, दो, चार और आठ लेबल ट्यूबों के लिए पॉलीथीलेनिमाइन स्पीयन के 0, 8, 1.6, 3.2, और 6.4 माइक्रोग्राम जोड़ें।कोमल पिपटिंग के साथ मिश्रण करने के बाद, पॉलीथीलेनिमाइन स्पियन सिर्ना कॉम्प्लेक्स बनाने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें। और मैं शुद्धता agarose के साथ एक तीन प्रतिशत agarose जेल तैयार करते हैं। इनक्यूबेशन के अंत में प्रत्येक ट्यूब में नमूने के पांच माइक्रोलीटर प्रति 6X डीएनए लोडिंग बफर का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और ध्यान से मिलाएं।फिर सभी नमूनों को जेल पर लोड करें। और पांच वोल्ट प्रति सेंटीमीटर पर इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं। जब तक ब्रोमोफेनॉल ब्लू डाई जेल पर लंबाई का दो तिहाई माइग्रेट नहीं करता।ट्रांसफेक्शन से एक दिन पहले पीबीएस के साथ RAW264.7 सेल कल्चर जैसे माउस माइक्रोफेज को धोएं। और पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर पांच से दस मिनट के लिए 25% ट्राइपसिन के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज करें । जब अधिकांश कोशिकाएं अलग हो जाती हैं।पूर्ण DMEN के पांच मिलीलीटर के साथ ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करें। फिर किसी भी सेल क्लस्टर को तितर-बितर करने के लिए समाधान को कई बार पिपेट करें। सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र के लिए बाँझ 15 मिलीलीटर शंकुटेल ट्यूब में स्थानांतरित करें।फिर मतगणना के लिए नए सिरे से पूर्ण DMEN के पांच मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को पूर्ण DMEN एकाग्रता के मिलीलीटर प्रति चौथी कोशिकाओं के लिए दस गुना 4.5 गुना तक पतला करें। और सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 24 घंटे की इनक्यूबेशन के लिए एक छह अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में मध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ें।अगले दिन एक १.५ मिलीलीटर आरएनए स्ट्रीम माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पॉलीथीलीनिमाइन स्पियन सिरना नैनोकणों का उचित अनुपात तैयार करें, जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है। और प्रत्येक कुएं में पॉलीथीनिमाइन स्पियन सिरना नैनोपार्टिकल कॉम्प्लेक्स की उचित मात्रा जोड़ें जिसे ताजा माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित किया गया है। पॉलीथीनिमाइन स्पीन एसआई परिसर तैयार करें।इस उदाहरण में पॉलीथीलीनीमाइन स्पियन के कई और महीनों का उपयोग इस प्रकार उनकी संभावित विषाक्तता को कम किया जा सकता है। फिर अच्छी तरह से नीचे से नैनोकणों का एक भी वितरण प्राप्त करने के लिए थाली ध्यान से भंवर । बाद में सेलुलर अपडेट या जीन नॉकडाउन कमी विश्लेषण तक प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में लौटाएं।पॉलीथीलीनीमाइन स्पीयन 30.5 और 37 मिलीवोल्ट्स की जीटा क्षमता के साथ प्रति मिलीलीटर 30 माइक्रोग्राम लोहे तक सांद्रता पर एक स्पष्ट साइटो विषाक्तता प्रदर्शित नहीं करता है। जो सामान्य रूप से सेल ट्रांसफैक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली एकाग्रता की तुलना में लगभग दो गुना किराया है। पॉलीथीलीनीमाइन स्पीन की 48 मिलीवोल्ट की ज़ेटा क्षमता हालांकि विषाक्त है।यहां तक कि सबसे कम खुराक पर जांच की। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के रूप में, कोशिकाओं के 90% से अधिक फ्लोरोसेंटी लेबल पॉलीथीनिमाइन स्पीन सिरीना परिसरों के साथ प्रति मिलीलीटर लोहे के 15 माइक्रोग्राम पर संक्रमित किया जा सकता है। नीले धुंधला कुचल द्वारा सेलुलर आंतरिककरण पर पॉलीथीलीनीमाइन स्पियन सिरना सांद्रता के प्रभाव का आकलन कम से कम 7.5 माइक्रोग्राम लोहे प्रति मिलीलीटर पर धुंधला पता चलता है।लेकिन स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले धब्बे प्रति मिलीलीटर लोहे के 15 माइक्रोग्राम पर जो पॉलीथीलेनिमाइन स्पियन सिरना तेज संतृप्ति के कारण होने की संभावना लोहे की उच्च सांद्रता में वृद्धि नहीं करते हैं। पॉलीथीनिमाइन स्पीन के शरण विशिष्ट सिरना से संक्रमित पेरिटोनियल मैक्रोफेज गैर-विशिष्ट सिराना की तुलना में टार्ज एमआरएनए के स्तर में काफी कमी प्रदर्शित करते हैं। सुझाव है कि सिरना एंडोसाइटिक वेसिकल्स से साइटोप्लाज्म में बच सकता है आरएनए हस्तक्षेप मशीनरी तक पहुंचने के लिए ।इसके अलावा पॉलीथीनिमाइन स्पियन सिराना नैनोपार्टिकल कॉम्प्लेक्स की एक खुराक के नसों में इंजेक्शन के बाद CD11b सकारात्मक और सीडी 3 सकारात्मक कोशिकाओं के फ्लोटेंकेस्ट्रिकल विश्लेषण सीडी 11b द्वारा नैनोकणों के एक अधिक कुशल तेज से पता चलता है सीडी 11b द्वारा किसी भी समय की जांच की अंगों में किसी भी समय बिंदु पर मैक्रोफेज व्यक्त । इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय पॉलीथीलीनीमाइन स्पियन को 37 मिलीवोल्ट्स से अधिक नहीं औसत डेटा क्षमता के साथ तैयार करना और कम लोहे पर पॉलीथीलेनिमाइन स्पियन सिरर्ना परिसरों को तैयार करना महत्वपूर्ण है। इस तकनीक के शोधकर्ताओं के लिए मानव रोग जैसे और कैंसर के पशु मोटर्स में मैक्रोफेज लक्ष्यीकरण की चिकित्सीय क्षमता का पता लगाने की जरूरत की तुलना करता है ।

Research

JoVE Journal

Medicine

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