Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

この作品は、中国の国家自然科学基金 (81772308) とキー研究開発中国プログラム (第 2017YFA0205502) によって支えられました。

含む生きた動物は動物に従って実行されたすべてのメソッドは気し、中国・東南大学のガイドラインを使用します。
1. プリンスエド ワード島 SPIONs の作製
<ol><li>
オレイン酸変性 SPIONs の作製
	<ol>
<li>した FeCl3•6H2O および FeSO4•7H2O N2の保護の下で水に溶解します。<ol>
<li>ビーカーにした FeCl3•6H2O の ...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

マクロファージは、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム、脂質種などの一般的に使用される nonviral アプローチを使って耐火物。ここでマクロファージ siRNA を使って信頼性と効率的な方法について説明しました。現在のプロトコルを使用して、以上マクロファージのような未加工 264.7 のセル (図 2 b) とラット腹腔マクロファージ18の 90% こ?...

マクロファージは、さまざまな量とはいえ体のすべての組織に分布する自然免疫系細胞の種類です。様々 なサイトカインや他のメディエーターを生産することによって、彼らは、微生物病原体の侵入に対する生体防御、損傷組織の修復、1組織の恒常性を維持するために重要な役割を果たします。その重要性のためマクロファージ継続的に集中的な研究の対象とされています。しかし、にもかかわらずその、遺伝子機能研究の有病率、siRNA による遺伝子サイレンシングはためマクロファージでは成功しにくいこれらの細胞、特に、プライマリ マクロファージ-transfect に困難が多い。これは毒性細胞膜は化学的に最もよく確立されたトランスフェクション アプローチに関連付けられている時 (例えばポリマーと脂質) の比較的高度に起因することができますまたは物理的に (例えば、電気穿孔法によると遺伝子銃) 中断 siRNA 分子マクロファージの生存率2,3を大幅に削減、膜を通過させる。さらに、マクロファージが専用食細胞分解酵素が豊富です。これらの酵素は、siRNA、特定遺伝子の siRNA は、細胞3,4に配信されている場合でも、その沈黙の効率を弱体化の整合性を損なうことができます。したがって、効果的なマクロファージ標的 siRNA 送達は配信4整合性および siRNA の安定性を保護する必要があります。
ますます機能不全マクロファージが開始し、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの特定の一般的な臨床疾患の進行に関与していることは明らかです。このためと、例えば、siRNA、マクロファージの機能を調節することは、これら疾患5,6,7を治療するための魅力的な方法論として発展しています。多くの進歩を遂げて、siRNA を用いた治療戦略の主要な挑戦は全身投与の siRNA とマクロファージは、望ましくない副作用につながる不十分な siRNA 吸収の悪い細胞の特異性。最適な細胞選択性に乏しいし、頻繁にオフ対象薬物ロードのナノ粒子 (NPs)、細網内皮系によってキャプチャされるの彼らの自発的な傾向により、副作用につながる無料核酸治療薬と比較してください。大食細胞は生体内で、最小限の副作用8と治療効果の向上を可能にする、受動的ターゲティングを設計することができます。無機ナノキャリア、様々 なリポソームや高分子9現在 NPs RNA 分子の配信のために探検が含まれます。その中でも、ポリエチレンイミン (PEI)、カチオン性高分子結合し、安定した NPs に核酸を凝縮できるのタイプは容量9,10を提供する最高の RNA を示しています。PEI は、核酸の酵素的及び非酵素的分解を防ぐ、セル膜を渡る彼らの転送を仲介する、自分の細胞内放出を促進します。当初 DNA 配信試薬として導入されたが、プリンスエド ワード島その後体内siRNA 配信、いずれかのローカルまたは全身9,10の魅力的なプラットフォームとなることを示した。
超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (SPIONs) は、生物医学、その磁気特性、生体適合性、生物学的に重要なオブジェクト、高表面面積、体積比に匹敵するサイズのために偉大な約束を示していると容易に適応病原体の添付ファイル11面。例えば、造影剤とマクロファージによる急速な吸収としてその潜在的なユーティリティのため SPIONs は、イメージ組織マクロファージ12好きな臨床ツールとして浮上しています。文献にはためのキャリアとして SPIONs のいくつかのレポートが含まれています SPIONs は核酸配信車11,13,14,15、我々 の知識としては広く研究もされている中マクロファージ標的 siRNA 送達。SPIONs による遺伝子デリバリーの彼らの表面は親水性カチオン性ポリマー、負荷電の核酸静電魅了できテザーの層でコーティング通常。その表面が低分子量 (10 kDa) 分岐プリンスエド ワード島 (PEI SPIONs) と変更された SPIONs を合成する方法を紹介します。これらの磁気 nanoplatforms の採用 siRNA は、細胞への siRNA トランスポートを有効にするプリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合を形成を凝縮していますし。我々 は、細網内皮のシステム16の細胞によって SPIONs の自発的な貪食能を理由バインディングの強力な能力と相まって、PEI SPIONs に siRNA の効率的な輸送に適したレンダリングしますペイによる核酸を凝縮マクロファージ。ここで表示されるデータは、PEI スパイ/siRNA による遺伝子サイレンシング文化だけでなく、体内のマクロファージの可能性をサポートします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

免疫応答の調節に重要な役割のためマクロファージは集中的な研究の対象とされている継続的に、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの多くの疾患で有望な治療上のターゲットを表します。プローブおよびマクロファージ機能を操作する任意の貴重なアプローチは、RNAi による遺伝子サイレンシングただし、マクロファージ siRNA トランスフェクションが頻繁に技術的に挑戦すると考慮し、現時点では、マクロファージに siRNA に専念ほとんど方法論 。ここでは、大食細胞への siRNA のターゲット配信の手段としてポリエチレンイミン被覆された超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (PEI SPIONs) を使用してのプロトコルを提案する.プリンスエド ワード島 SPIONs は、バインドおよび Fe: siRNA の重量比が 4 になったら完全に siRNA を凝縮、上記が可能です。生体外で、これらのナノ粒子が効率的に提供 siRNA プライマリ マクロファージとマクロファージのような未加工 264.7 のセル行の transfection のため最適な用量での妥協のセル実行可能性なしに、最終的には、彼らを誘導します。siRNA を介したターゲット遺伝子の沈黙。体外siRNA トランスフェクションに使用されている、離れて PEI SPIONs、また体内のマクロファージに siRNA を配信する有望なツールです。その磁気特性と遺伝子サイレンシングの能力の機能の組み合わせの観点から全身投与のペイ-スパイ/siRNA 粒子は、マクロファージの機能を調節するのみならず、マクロファージをイメージして追跡を有効にするを期待されています。PEI SPIONs が大食細胞への siRNA 配信簡単、安全、かつ効果的 nonviral プラットフォームを表します本質的の in vitroとin vivoの両方。

サイズとゼータ 29 48 nm の範囲、PEI SPIONs このプロトコルで準備の潜在性 (多分散性インデックス: 0.12 - 0.23) と 30 48 mV、それぞれ。12 ヶ月以上明らかな集計なしの 4 ° C で水に安定していた。彼らの siRNA の結合能を評価するには、PEI SPIONs Fe: siRNA 重量比はさまざまな siRNA と混合。図 1は、Fe: siRNA の重量比に達する 4 から無料 siRNA のバンドは完全に...

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Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

ポリエチレンイミン (PEI) を使用しての方法を述べる-siRNA 株マクロファージの超常磁性酸化鉄ナノ粒子をコーティングします。これらのナノ粒子は効率的に大食細胞の体外および体内と沈黙のターゲット遺伝子の発現を siRNA を提供できます。

小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

このメジャーは、主要な質問に答えるのに役立ちます。人間学の分野で。その答えは、病理学的状態に対する生理学的終わりの下でのマクロファージの機能における。この技術の主な利点は、ポリエチレンイミンコーティングが細胞を損なうことなく効率的にen vitroを可能にすることです。最適な用量の下で.この技術の意味は、多くの慢性炎症性疾患および癌の治療および診断に及ぶ。マクロファージが病因に不可欠な役割を果たす場所。手順を実証するナジアになります。私の研究室の大学院生。そして、カイシュアン・ワンはシャオフア博士の研究室の大学院生です。アリン酸修飾超常磁性酸化鉄ナノ粒子またはSPIONの最初の調製物は、塩化6水和物のファラスの28グラムを追加します。そして20グラムのファラは、80ミリリットルの脱イオン水を含むビーカーにヘプタハイドレートを自液する。そして、溶液に窒素を導入するためにガラス導管を使用しています。固形物が溶けるまで撹拌する。反応混合物を1分800回転で攪拌しながら摂氏72度に加熱します。そして、ビーカーに28%アンモニア水の40ミリリットルを追加します。5分後、9ミリリットルのアリル酸ドロップを賢明に加えます。そして、連続攪拌で3時間摂氏72度で混合物を維持します。インキュベーションの終わりに、得られた溶液を室温まで冷却する。そして、標準的なプロトコルに従って磁気分離を介して混合物を沈殿させる。次いで沈殿を含むSPIONを絶対エチルアルコールで3回洗浄します。そして、100ミリリットルのn-ヘキサンで沈殿物をアスペルスする。ジマーカプトアクリル酸を調製するために、SPIONの加えて800ミリグラムのアリン酸を加えたSPIONを修正した。200ミリリットルのn-ヘキサンと400ミリグラムのジマーカプトアクリル酸に分散し、200ミリリットルのアセトンを摂氏60度の水浴中の3つの首のフラスコに分散させた。次に、1分間に1000回転で攪拌し、還流して、フラスコに200マイクロリットルのトリエチルアミンドロップを加えます。黒色沈殿は、5時間後の磁気分離により得られる。次に、水酸化テトラメチルアンモニウムを使用して、脱イオン水中の親水性SPIONの均質分散液のpHを調整します。縮退ポリエチレンイミンは、SPIONを付加し、ジマーキャプトをアクリル酸修飾SPIONのコロイド溶液を10キロダルトンポリエチレンイミン溶液にドロップします。500ミリリットルの3つの首のフラスコで、1分間に1000回転で機械的に2時間攪拌する。インキュベーションの終わりに、100キロダルトンの分子量と15ミリリットルの含有量を遮断した超濾過チューブに得られた溶液を追加します。残りの溶液が1ミリリットルの体積に達するまでサンプルをセントラフを使用します。溶液に脱イオン水を加え、体積を15ミリリットルに戻します。そして、ちょうど実証したように、ソリューションをセントラフィンスして水分補給します。その後、摂氏4度で保存するための22ミクロンのフィルタを介して溶液をフィルタリングします。siRNAナノ粒子を調製するには、最初に調製した20マイクロモルsiRNA溶液の3マイクロリットルを5つの標識RNAの無料マイクロセントロアフィンスチューブに追加します。0、8、1.6、3.2、6.4マイクログラムのポリエチレンイミンSPIONをそれぞれゼロ、1、2、4、8とラベル付けしたチューブに加えます。穏やかなピペットと混合した後、ポリエチレンイミンSPION siRNA複合体を形成できるように、室温で30分間サンプルをインキュベートします。そして、I純度アガロースで3%アガロースゲルを調製する。インキュベーションの最後に、各チューブにサンプル5マイクロリットルあたり6X DNAローディングバッファーの1マイクロリットルを追加し、慎重に混合します。その後、すべてのサンプルをゲルにロードします。そして、5ボルト/センチメートルで電気泳動を実行します。ブロモフェノールブルー染料がゲルの長さの3分の2を移行するまで。トランスフェクションの1日前に、PBSでRAW264.7細胞培養のようなマウスマイクロファージを洗浄する。そして、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で5〜10分間、25%トリプシンの1ミリリットルで細胞を処理します。大部分の細胞が切り離されている場合。完全なDMENの5ミリリットルでトリプシンを不活性化します。次いで、溶液を数回ピピートして、任意の細胞クラスターを分散させる。細胞懸濁液を無菌15ミリリットルのコナッケルチューブに移して遠心分離します。その後、カウントのための新鮮な完全なDMENの5ミリリットルで細胞を再中断します。完全なDMEN濃度のミリリットル当たり4.5倍の4番目の細胞に細胞を希釈します。そして、細胞培養インキュベーター中の24時間のインキュベーションのために6つのウェルプレートの各ウェルに培地の2ミリリットルを追加します。翌日、ポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子の適切な比率を、ちょうど実証したように穏やかな混合で1.5ミリリットルのRNAストリームマイクロ遠心チューブで調製する。そして、ポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子複合体の適切な体積を、1ミリリットルの新鮮な培地に置き換えられた各ウェルに添加します。ポリエチレンイミンSPION si複合体を調製します。この例ではポリエチレンイミンSPIONの多くの月は、このようにそれらの潜在的な毒性を最小限に抑えて使用することができます.その後、プレートを慎重に旋回して、ウェルボトム全体にナノ粒子の均等な分布を達成します。その後の細胞更新または遺伝子ノックダウン欠損解析まで、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。ゼータ電位30.5および37ミリボルトのポリエチレンイミンSPIONは、1ミリリットル当たり30マイクログラムまでの濃度で明らかな細胞毒性を示さない。これは、通常、細胞トランスフェクションに使用される濃度よりも約2倍のレンタルです。ポリエチレンイミンSPIONのゼータポテンシャルは48ミリボルトですが有毒です。検査された最低用量でも。フローサイトメトリーで分析したように、細胞の90%以上は、1ミリリットル当たり15マイクログラムの鉄で蛍光標識ポリエチレンイミンSPION siRNA複合体でトランスフェクトすることができます。青い染色を破砕することによって細胞内在化に及ぼすポリエチレンイミンSPION siRNA濃度の影響の評価は、1ミリリットル当たり7.5マイクログラムの鉄での最小検出可能な染色を明らかにする。しかし、ポリエチレンイミンSPION siRNA取り込みの飽和のために鉄のより高い濃度で増加しない1ミリリットル当たり鉄の15マイクログラムではっきりと目に見えるスポット。ポリエチレンイミンSPIONの収容特異的なsiRNAを有する腹膜マクロファージは、非特異的なsiRNAと比較してタール系mRNAレベルの有意な減少を示す。siRNAがエンドサイトージクルから細胞質に脱出してRNA干渉機械に到達できることを示唆する。さらに、CD11b陽性およびCD3陽性細胞のポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子複合体の単回投与の静脈注射後、CD11bによってナノ粒子のより効率的な取り込みを明らかにし、CD11bによってマクロファージを発現するマクロファージをCD11bによって、検査した全臓器の任意の時点で行う。この手順を試みている間に、37ミリボルト以下の平均データ電位を有するポリエチレンイミンSPIONを調製し、低鉄対siRNA比でポリエチレンイミンSPION siRNA複合体を調製することを忘れないでください。この技術は、研究者が癌などのヒト疾患の動物モーターにおけるマクロファージを標的とする治療可能性を探求する必要性を比較する。

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

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Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

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Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

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Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

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Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

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Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

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新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

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In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

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In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

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