Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81772308)와 국가 핵심 연구 및 중국의 개발 프로그램 (No. 2017YFA0205502)에 의해 지원 되었다.

관련 된 동물 동물에 따라 수행한 모든 방법을 조심 하 고 동남 대학, 중국의 지침을 사용 하 여.
1입니다. 페이 SPIONs의 준비
<ol><li>
올레산 수정 SPIONs의 준비
	<ol>
<li>FeCl3•6H2O와 FeSO4•7H2O N2의 보호 아래 물에 용 해.<ol>
<li>비 커에 FeCl3•6H2O의 28 g와 FeSO4•7H2O 이온된 물 80 mL에 20 g을 추가 합?...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. 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Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

대 식 세포는 일반적으로 사용 되 nonviral 접근, electroporation, 양이온 리 등 지질 종에 의해 transfect 내 화물. 여기 우리 transfect siRNA와 대 식 세포를 안정적이 고 효율적인 방법을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, 이상 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 (그림 2B)와 쥐 복 막 대 식 세포18 의 90% 수 수 페 세포 생존 능력의 중요 한 장애 없이 siRNA와. 이 메서?...

대 식 세포는 다른 금액에도 불구 하 고 모든 신체 조직에 배포 하는 타고 난 면역 세포의 유형입니다. 생산 함으로써 다양 한 cytokines 및 다른 중재자, 그들은 중요 한 역할을 재생 하는 미생물 병원 체 침입에 대 한 호스트 방어, 다음 부상, 조직 복구 및 조직의 항상성1를 유지 하. 그들의 중요성 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 주제 되었습니다 합니다. 그러나, 유전자 조절 및 기능 연구에 있는 그것의 보급에도 불구 하 고 중재 하는 siRNA 유전자 침묵은 대 식 세포 때문에 성공 가능성이 이러한 셀-특히, 주 대 식 세포-는 종종 transfect 어렵다. 이 독성 연관 있는 세포 막 화학은 가장 잘 설립 transfection 접근 (예를 들면, 고분자와 지질)의 상대적으로 높은 수준의 관찰 작용 수 있다 또는 육체적으로 (예를 들어, electroporation 여 고 유전자 총) 교차 하는 그로 인하여 크게 줄이고 세포의 생존2,3막 siRNA 분자를 방해 합니다. 또한, 대 식 세포는 전용된 phagocytes degradative 효소 풍부. 이러한 효소 siRNA, 유전자 특정 siRNA의 셀3,4로 전달 하는 경우에 그 입을 효율성 약화의 무결성을 손상 수 있습니다. 따라서, 효과적인 macrophage 대상으로 siRNA 전달 시스템 납품4siRNA의 안정성과 무결성을 보호 하기 위해 필요 합니다.
역 기능 세포 개시와 자가 면역 질환, 동맥 경화, 고 암 같은 특정 일반적인 임상 질환의 진행에 연루는 점점 더 분명 하다. 이러한 이유로, 대 식 세포 기능을, 예를 들어, siRNA, 변조 치료 이러한 장애5,,67에 대 한 매력적인 방법론으로 신흥 되었습니다. 많은 진행 했다, siRNA 기반 치료 전략의 주요 과제는 체계적으로 관리 siRNA와 대 식 세포, 따라서 원치 않는 부작용으로 이어질에 의해 부족 한 siRNA 통풍 관의 불 쌍 한 세포 특이성. 일반적으로 최적의 셀 선택도 부족 하 고 종종 오프 대상 부작용, 약물 로드 (NPs), 나노의 reticuloendothelial 시스템에 의해 점령 되 고 그들의 자발적인 성향 때문으로 이어질 무료 핵 산 치료제와 비교 수동 타겟팅 세포에 vivo에서, 최소한의 부작용8향상 된 치료 효능에 대 한 수 있도록 설계 될 수 있다. 현재 NPs RNA 분자의 배달에 대 한 탐험 등 무기 nanocarriers, 다양 한 리, 고분자9. 그 중 polyethyleneimine (페이), 양이온 고분자 바인딩 및 안정된 NPs로 집 광 하는 핵 산의 종류 용량9,10를 제공 하는 가장 높은 RNA를 보여줍니다. 페이, 세포 막에 걸쳐 그들의 전송을 중재 및 그들의 세포내 방출 촉진 효소와 nonenzymatic 저하에서 핵 산을 보호 한다. 비록 처음 DNA 배달 시 약으로 도입, 페이 이후에 로컬 하나 siRNA 전달 vivo에서 또는 체계적으로9,10매력적인 플랫폼으로 시연 했다.
Superparamagnetic 산화 철 나노 입자 (SPIONs) 생물의 약, 그들의 자기 특성, 생체 적합성, 생물학으로 중요 한 개체, 높은 표면 지역에 양 비율에 비해 크기 때문에 큰 약속을 보여왔다 고 쉽게 적응 표면 bioagent 첨부 파일11. 예를 들어, 그들의 잠재적인 유틸리티 대조 대리인 및 대 식 세포에 의해 급속 한 통풍 관으로, 때문에 SPIONs 이미지 조직 대 식 세포12좋아하는 임상 도구로 떠오르고 있다. 문학에 대 한 캐리어로 SPIONs의 몇 가지 보고서가 포함 되어 동안 SPIONs 또한 광범위 하 게 연구 핵 산 배달 차량11,13,,1415, 우리의 지식, 대 식 세포를 대상으로 siRNA 전달입니다. SPIONs에 의해 유전자 배달에 대 한 그들의 표면은 일반적으로 친수성 양이온 폴리머는 부정적으로 위탁 된 핵 산 정전 끌었다 고 수 곁의 층으로 입힌 다. 여기, 우리가 그 표면 낮은 분자-무게 (10 kDa), 분기 페이 (PEI SPIONs) 수정 됩니다 SPIONs을 합성 하는 방법을 제시. 이러한 자기 nanoplatforms 다음 셀에 siRNA 전송 수 있도록 페이-스파이/siRNA 복합물을 형성 하는 siRNA를 압축 하는 채택 된다. 우리 reticuloendothelial 시스템16의 세포에 의해 SPIONs의 자발적인 먹어서 그 이유, 바인딩의 강한 능력이 함께 하 고 페이 SPIONs를 siRNA에의 효율적인 전송에 적합 렌더링 응축 핵 산 페이, 여 대 식 세포입니다. 여기에 제시 된 데이터 지원으로 문화 뿐만 아니라 vivo에서세포에 페이 스파이/siRNA-중재 된 유전자 침묵의 타당성.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

면역 반응 조절에 그들의 중요 한 역할 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 대상이 되고있다 하 고 자가 면역 질환, 동맥 경화, 암 등 여러 질환에 유망한 치료 대상 대표. 프로브; 대 식 세포 기능을 조작 하는 선택의 귀중 한 접근은 RNAi 중재 한 유전자 침묵 그러나, siRNA와 대 식 세포의 transfection 종종 기술적으로 도전으로 간주 하 고, 현재, 대 식 세포를 siRNA 전송에 전념 하는 몇 가지 방법론을 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 siRNA의 세포 타겟된 배달에 대 한 차량으로 polyethyleneimine 코팅 superparamagnetic 철 산화물 나노 입자 (페이-SPIONs)를 사용 하 여 프로토콜을 제시. PEI SPIONs 바인딩 및 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 완전히 siRNA를 콘 덴 싱의 고 위에 할 수 있다. 생체 외에서이러한 나노 수 효율적으로 제공 siRNA transfection에 대 한 최적의 복용량에서 손상 세포 생존 능력 없이 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 라인에 뿐만 아니라 기본 세포로 하 고, 궁극적으로, 그들은 유도 siRNA 중재 대상 유전자 침묵입니다. SiRNA transfection 생체 외에서 사용 되 고, 떨어져 페이 SPIONs 세포에서 vivo에서를 siRNA를 제공 하기 위한 유망한 도구 있습니다. 자기적 성질 및 유전자 침묵 능력의 결합된 기능에 비추어 체계적으로 관리 페이-스파이/siRNA 입자 뿐만 아니라 대 식 세포 기능 조절 뿐만 아니라 몇 군데를 추적 세포 활성화 예상 된다. 페이-SPIONs 대 식 세포를 siRNA 전달, 안전, 간단 하 고 효과적인 nonviral 플랫폼을 대표 하는 본질적으로, 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.

크기와 제타 페이-SPIONs이이 프로토콜을 사용 하 여 준비의 잠재력 29-48 nm의 범위에 있었다 (증가할수록 인덱스: 0.12-0.23) 및 30-48 mV, 각각. 그들은 분명 집계 없이 12 개월 동안 4 ° C에 물에서 안정 되어 있었다. 능력을 바인딩 그들의 siRNA를 평가 하려면 페이 SPIONs 다양 한 Fe: siRNA 무게 비율에 siRNA와 혼합 했다. 그림 1 는 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 ?...

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Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

이 측정값은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인문학 분야에서. 병리학적 조건에 생리적 끝에 있는 대식세포 의 기능에 있는 그 대답.이 기술의 주요 장점은 코팅 된 폴리에틸렌네이민이 세포를 손상시키지 않으면서 효율적으로 생체 외에서 할 수 있다는 것입니다. 최적의 복용량에서. 이 기술의 의미는 많은 만성 염증 성 장애및 암의 치료와 진단으로 확장됩니다.대식세포가 병인에 필수적인 역할을 하는 곳. 절차를 시연하는 것은 나지아가 될 것입니다. 내 실험실에서 대학원생.그리고 Kaixuan 왕 박사 샤오화 박사의 실험실에서 대학원 생. 아렐산 수정 슈퍼 파라자성 산화나노입자 또는 SPION의 첫 번째 28그램의 파라클로리드 헥사하이드레이트를 준비한다. 그리고 20 그램 의 파라는 탈이온 화 물의 80 밀리리터를 포함하는 비커에 heptahydrate.그리고 유리 도관을 사용하여 용액에 질소를 도입하십시오. 고체 물질이 용해될 때까지 저어줍니다. 반응 혼합물을 섭씨 72도로 가열하여 분당 800회전에서 저어줍니다.그리고 비커에 28 %의 암모니아 물 40 밀리리터를 추가합니다. 5분 후 9밀리리터의 아일산 드롭을 현명하게 추가합니다. 그리고 연속 교반과 3 시간 동안 섭씨 72도에서 혼합물을 유지합니다.인큐베이션의 끝에서 실온에 대한 결과 솔루션을 냉각시. 및 표준 프로토콜에 따라 자기 분리를 통해 혼합물을 침전한다. 그런 다음 침전을 함유한 SPION을 절대 에틸 알코올로 세 번 씻는다.그리고 n-헥산의 100 밀리리터에 침전을 배분. 디메카토 아크릴산을 준비하려면 변형된 SPION의 800 밀리그램의 아를랄산 변형 SPION의 추가. 200밀리리터의 n-헥산과 400밀리그램의 이압성 아크릴산에 분산되어 200밀리리터의 아세톤에 60°C의 수조에서 3개의 목 플라스크에 분산되어 있습니다.다음으로 분당 1000회전에서 교반하고 역류를 가하는 플라스크에 트리에틸라민 드롭 200마이크로리터를 넣습니다. 검은 침전은 5시간 후에 자기 분리에 의해 얻어질 수 있다. 그런 다음 테트라메틸람모늄 수산화를 사용하여 용액의 pH를 조절하여 탈이온화된 물에서 수성 성 SPION의 동질 분산용 용액을 조절한다.퇴화 폴리에틸렌네이민 코팅 SPION's는 디메카토 아크릴산을 첨가하여 SPION의 콜로이드 용액을 10킬로달톤 폴리에틸렌네이민 용액으로 현명하게 떨어뜨립니다. 500 밀리리터에서 2 시간 동안 분당 1000 회전에서 기계적 교반 에서 세 목 플라스크. 인큐베이션의 끝에서 100킬로달톤의 분자량이 차단되고 15 밀리리터의 함량을 가진 울트라 여과 튜브에 결과 용액을 추가합니다.나머지 용액이 1밀리리터 부피에 도달할 때까지 샘플을 센트라퓨즈합니다. 용액에 탈이온화된 물을 추가하여 볼륨을 15 밀리리터로 되돌려 보세요. 그리고 단지 입증된 바와 같이 10배 더 솔루션을 다시 수분하고 재수화합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 보관할 수 있도록 22미크론 필터를 통해 용액을 필터링합니다. siRNA 나노 입자를 준비하기 위해 먼저 5 개의 라벨이 부착 된 RNA의 무료 마이크로 센트로아프로폰 튜브에 갓 준비 된 20 마이크로 몰라 siRNA 솔루션 3 마이크로 리터를 추가합니다. 그리고 각각 0, 8, 1.6, 3.2 및 6.4 마이크로그램의 폴리에틸렌네이민 SPION을 0, 1, 2, 4 및 8로 표시한 튜브에 추가합니다.부드러운 파이펫팅과 혼합한 후, 실온에서 30분 동안 시료를 배양하여 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 복합체가 형성되도록 합니다. 그리고 순도 아가로즈와 함께 3% 아가로즈 젤을 준비합니다. 인큐베이션의 끝에 각 튜브에 샘플의 5 마이크로 리터 당 6X DNA 로딩 버퍼의 하나의 마이크로 리터를 추가하고 신중하게 혼합.그런 다음 모든 샘플을 젤에 로드합니다. 그리고 전기 전도를 센티미터당 5볼트로 실행합니다. 브로모페놀 블루 염료가 겔 길이의 3분의 2를 이동할 때까지.1일 전에 는 PBS를 사용하여 RAW264.7 세포 배양과 같은 마우스 미세파기를 세척한다. 그리고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5~10분 동안 25%의 트립신1밀리리터로 세포를 치료합니다. 세포의 대다수가 분리되었을 때.완전한 DMEN의 5 밀리리터와 트립신을 비활성화합니다. 그런 다음 모든 셀 클러스터를 분산시키기 위해 용액을 여러 번 배분합니다. 세포 현탁액을 멸균 15 밀리리터 코나켈 튜브로 전달하여 원심분리를 한다.그런 다음 계산을 위해 신선한 완전한 DMEN의 5 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 완전한 DMEN 농도의 밀리리터 당 4 세포에 4.5 배 10 배 세포를 희석. 그리고 세포 배양 인큐베이터에서 24 시간 배양에 대한 6 개의 웰 플레이트의 각 웰에 2 밀리리터를 추가합니다.다음날 1.5 밀리리터 RNA 스트림 미세 원심분리기 튜브에서 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 나노입자의 적절한 비율을 준비하여 부드럽게 혼합한다. 그리고 폴리에틸렌아이민 SPION siRNA 나노입자 복합체의 적절한 부피를 신선한 배지의 1밀리리터로 대체하였다. 폴리에틸렌네이민 스피온 시 복합체를 준비한다.이 경우 폴리에틸렌네이민 SPION의 더 많은 달이 사용될 수 있으므로 잠재적인 독성을 최소화할 수 있다. 그런 다음 플레이트를 조심스럽게 소용돌이어 우물 바닥에 걸쳐 나노 입자의 균일 한 분포를 달성합니다. 후속 세포 업데이트 또는 유전자 녹다운 결핍 분석까지 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.30.5 및 37 밀리볼트의 제타 잠재력을 가진 폴리에틸렌네이민 SPION은 밀리리터 당 최대 30 마이크로그램의 철분 농도에서 명백한 사이토 독성을 나타내지 않습니다. 이는 일반적으로 세포 형질에 사용되는 농도보다 약 2 배 고용이다. 폴리에틸렌네이민 스피온의 제타 잠재력 48 밀리볼트는 그러나 독성이 있다.심지어 가장 낮은 복용량에서 검사. 유동 세포측정에 의해 분석된 바와 같이, 세포의 90% 이상이 밀리리터당 15마이크로그램의 철분에서 형광으로 표지된 폴리에틸렌아이민 SPION siRNA 복합체로 전염될 수 있다. 블루 스테인링을 분쇄하여 세포 내화에 대한 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 농도의 효과에 대한 평가는 밀리리터 당 7.5 마이크로그램의 철분에서 최소한의 검출 가능한 염색을 보여줍니다.그러나 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 섭취량으로 인해 더 높은 농도의 철분농도에서 증가하지 않는 밀리리터당 15 마이크로그램의 철분에서 명확하게 눈에 띄는 반점이 명확하게 드러난다. 폴리에틸렌아이민 SPION의 특정 siRNA항구로 감염된 회리세포는 비특이적 siRNA에 비해 타지 mRNA 수치가 현저한 감소를 나타낸다. siRNA는 RNA 간섭 기계에 도달하기 위하여 세포질로 내세포 소포에서 탈출할 수 있다는 것을 건의합니다.또한 1회 투여량의 폴리에틸렌에이민 스피온 siRNA 나노입자 복합체의 정맥 주사 후 CD11b 양성 및 CD3 양성 세포의 flocentimetrical 분석을 통해 검사된 모든 기관에서 CD3 양성 세포보다 더 효율적인 세포세포를 발현하는 CD11b에 의한 나노입자의 보다 효율적인 섭취를 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안 37 밀리볼트보다 높지 않은 평균 데이터 잠재력을 가진 폴리에틸렌네이민 SPION의 준비를 기억하고 낮은 철에 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 복합체를 siRNA 비율에 준비하는 것이 중요합니다. 이 기술은 연구원이 암과 같은 인간 질병의 동물 모터에 있는 대식세포를 표적으로 하는 치료 잠재력을 탐구하는 필요를 비교합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애에 드 노보 변이를 식별하는 전략

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

연구

의학

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

쥐의 망막에 Elvax 40W를 통해 서방 약물 전달 : 만성 질환의 치료를위한 시사점

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

생물 검정으로 소 장간막 동맥과 정맥의 섹션을 분리하고 사용하면 소장에서 Vasoactivity을 테스트

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

자궁 원격 측정은 마우스 수축 압력을 측정하는<em&gt; 생체</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Vivo에서 골절 뼈 쥐 마우스 대 퇴 골에 대 한 MRI-호환 Osteosynthesis 장치를 사용 하 여 치료 기간 동안 굳은 살 개발의 평가

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...