Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (81772308) og National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (nr. 2017YFA0205502).

Alle metoder som involverer bo dyrene ble utført i samsvar med dyret vare og bruk retningslinjer Sørøst University, Kina.
1. utarbeidelse av PEI-SPIONs
<ol><li>
Utarbeidelse av oljesyre endret SPIONs
	<ol>
<li>Oppløse FeCl3•6H2O og FeSO4•7H2O i vannet under beskyttelse av N2.<ol>
<li>Legge til 28 g av FeCl3•6H2O og 20 g FeSO4•7H2O i 80 mL deionisert vann i et beaker...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

Makrofager er ildfaste til transfect av brukte nonviral tilnærminger, som electroporation, kationisk liposomer og lipid arter. Her beskrev vi en pålitelig og effektiv metode for å transfect makrofager med siRNA. Bruker stede protokollen, kan over 90% av macrophage som rå 264.7 celler (figur 2B) og rotten peritoneal makrofager18 være transfected med siRNA uten betydelig svekkelse av cellen levedyktighet. Denne metoden avhenger levering plattformen PEI-SPION, som e...

Makrofager er en medfødt immunceller distribuert i alle kroppens vev, men i forskjellige beløp. Ved å produsere en rekke cytokiner og andre meglere, spiller de avgjørende roller i vert forsvar mot invaderende mikrober patogener i reparasjon av vev etter skade og opprettholde vev homeostase1. På grunn av deres betydning vært makrofager kontinuerlig gjenstand for intensiv forskning. Men til tross for dens utbredelse i genet regulering og funksjon studier, siRNA-mediert genet stanse er mindre sannsynlig å lykkes i makrofager fordi disse cellene, spesielt primære makrofager, er ofte vanskelig å transfect. Dette kan tilskrives en relativt høy grad av toksisitet knyttet mest veletablerte transfection tilnærminger som cellemembranen er kjemisk (f.eksmed polymerer og lipider) eller fysisk (f.eksav electroporation og Gene kanoner) forstyrret la siRNA molekylene krysse membranen, og dermed drastisk redusere makrofager levedyktighet2,3. Videre er makrofager dedikert phagocytes rik på degradative enzymer. Disse enzymene kan skade integriteten til siRNA, svekke effektiviteten stanse selv om gen-spesifikke siRNA er levert til celle3,4. En effektiv macrophage målrettede siRNA leveringssystem må derfor beskytte integritet og stabilitet av siRNA under levering4.
Det er stadig mer tydelig at dysfunksjonelle makrofager er innblandet i initiering og progresjon av visse felles klinisk lidelser som autoimmune sykdommer, åreforkalkning og kreft. Derfor modulerende macrophage funksjon med, for eksempel siRNA, har vært fremstår som en attraktiv metode for behandling av disse lidelser5,6,7. Selv om mye fremgang har blitt gjort, er en stor utfordring for siRNA-basert behandling strategi dårlig celle spesifisitet systemisk administrert siRNA og utilstrekkelig siRNA opptaket av makrofager, som følgelig føre til uønskede bivirkninger. Sammenlignet med gratis nukleinsyre legemiddelselskap som vanligvis ikke optimal celle selektivitet og ofte fører til off-målet bivirkninger, narkotika-lastet nanopartikler (NPs), på grunn av sine spontane tilbøyelighet av tilværelse fanget av reticuloendothelial systemet, kan være konstruert for passiv målretting til makrofager i vivo, muliggjør forbedret terapeutiske effekten med minimale bivirkninger8. Gjeldende NPs utforsket for levering av RNA molekyler inkluderer uorganiske nanocarriers og ulike liposomer polymerer9. Blant dem viser polyethyleneimine (PEI), en type kationisk polymerer bindende og kondenserende nukleinsyrer inn stabilisert NPs, den høyeste RNA levere kapasitet9,10. PEI beskytter nukleinsyrer fra enzymatisk og nonenzymatic fornedrelse, formidler deres overføring over cellemembranen og fremmer deres intracellulær utgivelse. Selv om opprinnelig introdusert som en DNA levering reagens, ble PEI deretter vist for å være en attraktiv plattform for i vivo siRNA levering, enten lokalt eller systemisk9,10.
Superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (SPIONs) har vist store løftet i biomedisin, takket være deres magnetiske egenskaper, biocompatibility, tilsvarende størrelse på biologisk viktig objekter, høy overflate-område-til-volum forhold, og lett å manøvrere overflate for bioagent vedlegg11. For eksempel på grunn av deres potensielle nytte som en kontrast agent og raske opptak av makrofager, SPIONs har dukket opp som en favoritt klinisk verktøy bilde vev makrofager12. Mens SPIONs har også vært grundig studert som nukleinsyre levering biler11,13,14,15, til vår kunnskap, inneholder litteraturen noen rapporter om SPIONs som en bærer for macrophage målrettede siRNA levering. For gen levering av SPIONs, er deres overflate vanligvis belagt med et lag av hydrofile kationisk polymerer som negativt ladde nukleinsyrer kan elektrostatisk tiltrukket og bundet. Her presenterer vi en metode for å syntetisere SPIONs som overflaten er endret med lav-molekylvekt (10 kDa), forgrenede PEI (PEI-SPIONs). Disse magnetiske nanoplatforms er da ansatt å kondensere siRNA, danner PEI-SPION/siRNA komplekser som gjør siRNA transport inn i cellen. Vi grunn at spontan fagocytose av SPIONs av celler reticuloendothelial systemet16, kombinert med sterke evne til binding og kondenserende nukleinsyrer ved PEI, gjengir PEI-SPIONs egnet for effektiv transport av siRNA til makrofager. Dataene som presenteres her støtte muligheten for PEI-SPION/siRNA-mediert genet stanse i makrofager kultur som i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

På grunn av deres avgjørende rolle i å regulere immunreaksjoner, makrofager kontinuerlig har vært gjenstand for intensiv forskning og representerer en lovende terapeutisk mål i mange lidelser, som autoimmune sykdommer, åreforkalkning og kreft. RNAi-mediert genet stanse er en verdifull tilnærming av valget for å undersøke og manipulere macrophage funksjon; men hva av makrofager med siRNA anses ofte å være teknisk utfordrende, og i dag, noen metoder dedikert til siRNA overføring til makrofager er tilgjengelig. Her presenterer vi en protokoll for å bruke polyethyleneimine-belagt superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (PEI-SPIONs) som et redskap for målrettet levering av siRNA til makrofager. PEI-SPIONs er i stand til å binde og helt kondenserende siRNA når Fe: siRNA vektforholdet når 4 og over. In vitro, disse nanopartikler kan effektivt levere siRNA til primære makrofager, samt i macrophage som rå 264.7 celle linje, uten akkord celle levedyktighet på optimale dosen for hva, og, til slutt, de induserer siRNA-mediert målet genet støydemping. Foruten å være brukt for i vitro siRNA transfection, er PEI-SPIONs også et lovende verktøy for å levere siRNA til makrofager i vivo. I lys av sin kombinert funksjoner av magnetisk egenskap og slå av genet evne forventes systemisk administrert PEI-SPION/siRNA partikler ikke bare å modulere macrophage funksjon, men også aktivere makrofager fotografert og spores. I hovedsak PEI-SPIONs representerer en enkel, sikker og effektiv nonviral plattform for siRNA levering til makrofager både i vitro og i vivo.

Størrelsen og zeta potensialet i PEI-SPIONs med denne protokollen var mellom 29-48 nm (polydispersity indeks: 0,12 - 0,23) og 30-48 mV, henholdsvis. De var stabil i vann 4 ° C over 12 måneder uten åpenbare aggregering. For å evaluere deres siRNA bindende evne, ble PEI-SPIONs blandet med siRNA på forskjellige Fe: siRNA vekt forhold. Figur 1 viser at når Fe: siRNA vektforholdet når 4 og over, av gratis siRNA var helt mangler, noe vellykket siRNA binding...

Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Vi beskriver en metode for å bruke polyethyleneimine (PEI)-belagt superparamagnetiske jernoksid nanopartikler for transfecting makrofager med siRNA. Disse nanopartikler kan effektivt levere siRNA til makrofager i vitro i vivo og stillhet målet genuttrykk.

Polyethyleneimine-belagt jernoksid nanopartikler som et redskap for levering av lite forstyrrende RNA til makrofager i Vitro og Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Dette tiltaket kan bidra til å besvare viktige spørsmål. Innen humanologi. Det svaret i funksjonen av makrofager under fysiologisk slutt på patologiske forhold.Den største fordelen med denne teknikken er at polyetylenimin belagt kan effektivt en vitro uten å gå på akkord med celle. Under optimale doser. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot terapi og diagnose av mange kroniske inflammatoriske lidelser og kreftformer.Hvor makrofager spiller viktig rolle i patogenesen. Å demonstrere prosedyren vil være Na Jia. En avgangsstudent fra laboratoriet mitt.Og Kaixuan Wang er utdannet student fra Dr. Xiaohuas laboratorium. For å forberede allylic acid modifisert super paramagnetisk jernoksid nanopartikler eller SPION første legge til 28 gram pharas klorid heksahydrat. Og 20 gram pharas selfate heptahydrat til et beger som inneholder 80 milliliter av deionisert vann.Og bruk en glassrør for å introdusere nitrogen i løsningen. Rør til den faste materien er oppløst. Varm reaksjonsblandingen til 72 grader Celsius ved omrøring ved 800 rotasjoner per minutt.Og tilsett 40 milliliter med 28% ammoniakkvann til begeret. Etter fem minutter tilsett ni milliliter alliertsyredråpe klokt. Og opprettholde blandingen ved 72 grader Celsius i tre timer med kontinuerlig omrøring.På slutten av inkubasjonen avkjøles den resulterende løsningen på romtemperatur. Og utløse blandingen via magnetisk separasjon i henhold til standardprotokoller. Vask deretter SPION som inneholder bunnsprecipitat tre ganger med absolutt etylalkohol.Og asperse bunnskuddet i 100 milliliter n-hexane. For å forberede dimercapto akrylsyre modifisert SPION legge 800 milligram av allylic syre modifisert SPION.s. Spredt i 200 milliliter n-heksan og 400 milligram dimercapto akrylsyre spredt i 200 milliliter aceton i en tre nakkekolbe i et vannbad på 60 grader Celsius.Deretter legger du til 200 mikroliter trietyamindråpe klokt til kolben med omrøring ved 1000 rotasjoner per minutt og refluksing. Et svart bunnskudd kan oppnås ved magnetisk separasjon etter fem timer. Bruk deretter tetramethylammoniumhydroksid til å justere pH-en til løsningen for homogen spredning av hydrofile SPION-er i deionisert vann.Degenerert polyetylenimin belagt SPION's legge dimercapto akrylsyre modifisert SPION kolloidal løsning slippe klok inn i en 10 kilodalton polyetylenimin løsning. I en 500 milliliter tre nakkekolbe under mekanisk omrøring ved 1000 rotasjoner per minutt i to timer. På slutten av inkubasjonen legger du til den resulterende løsningen til et ultrafiltreringsrør med en molekylvekt avskåret av 100 kilodaltonn og et innhold på 15 milliliter.Sentrafuse prøven til den gjenværende løsningen når et ett milliliter volum. Tilsett deionisert vann til løsningen for å bringe volumet tilbake til 15 milliliter. Og sentrafus og rehydrere løsningen ti ganger til som nettopp demonstrert.Deretter filtrerer du løsningen gjennom et 22 mikronfilter for lagring ved fire grader Celsius. For å forberede siRNA nanopartikler først legge til tre mikroliter av nylaget 20 mikromolar siRNA løsninger til fem merket RNA gratis mikrocentroafused rør. Og legg til 0, 8, 1,6, 3,2 og 6,4 mikrogram polyetylenimine SPION til rør merket null, en, to, fire og åtte henholdsvis.Etter blanding med skånsom pipettering, inkuber prøvene i 30 minutter ved romtemperatur for å la polyetylenimine SPION siRNA-kompleksene dannes. Og lag en tre prosent agarose gel med jeg renhet agarose. På slutten av inkubasjonen legger du til en mikroliter 6X DNA-lastbuffer per fem mikroliter prøve til hvert rør og bland forsiktig.Legg deretter alle prøvene på gelen. Og kjør elektroforese på fem volt per centimeter. Inntil bromophenol blå fargestoff migrerer to tredjedeler av lengden på gelen.En dag før transfection vaske en mus mikrofôr som RAW264.7 cellekultur med PBS. Og behandle cellene med en milliliter på 25% trypsin i fem til ti minutter ved 37 grader Celsius i en fem prosent karbondioksidinkubator. Når de fleste cellene har løsnet.Inaktiver trypsin med fem milliliter komplett DMEN. Deretter pippete løsningen flere ganger for å spre noen celleklynger. Overfør cellefjæringen til et sterilt konakellrør på 15 milliliter for sentrifugering.Deretter re suspendere cellene i fem milliliter med frisk komplett DMEN for telling. Fortynn cellene til en 4,5 ganger ti til de fjerde cellene per milliliter fullstendig DMEN-konsentrasjon. Og legg til to milliliter medium til hver brønn av en seks brønnplate for en 24 timers inkubasjon i cellekulturinkubatoren.Neste dag forberede riktig forhold mellom polyetylenimine SPION siRNA nanopartikler i en 1,5 milliliter RNA stream microcentrifuge rør med mild blanding som nettopp demonstrert. Og tilsett riktig volum av polyetylenimin SPION siRNA nanopartikkel kompleks til hver brønn som har blitt erstattet med en milliliter frisk medium. Forbered polyetylenimine SPION si komplekser.i dette tilfellet mange flere måneder med polyetylenimin SPION kan brukes Dermed minimere deres potensielle toksisitet. Virvle deretter platen nøye for å oppnå en jevn fordeling av nanopartiklene over brønnbunnene. Returner platen til cellekulturinkubatoren til påfølgende cellulær oppdatering eller genbankemangelanalyse.Polyetylenimin SPION's med et zeta potensial på 30,5 og 37 millivolts viser ikke en tilsynelatende cyto toksisitet ved konsentrasjoner opp til 30 mikrogram jern per milliliter. Som er omtrent to ganger leie enn konsentrasjonen som vanligvis brukes for celletransfection. Polyetylenimine SPION zeta potensial på 48 millivolts men er giftig.Selv ved den laveste dosen undersøkt. Som analysert av flytcytometri, mer enn 90% av cellene kan transiseres med fluorescerende merket polyetylenimine SPION siRNA komplekser på 15 mikrogram jern per milliliter. Vurdering av effekten av polyetylenimine SPION siRNA konsentrasjoner på cellulær internalisering ved å knuse blå flekker avslører minimalt påviselig farging på 7,5 mikrogram jern per milliliter.Men tydelig synlige flekker ved 15 mikrogram jern per milliliter som ikke øker ved høyere konsentrasjoner av jern sannsynligvis på grunn av polyetylenimin SPION siRNA opptakmetning. Peritoneale makrofager transfisert med polyetylenimine SPION husing spesifikke siRNA viser en betydelig nedgang i targe mRNA nivåer sammenlignet med uspesifikke siRNA. Noe som tyder på at siRNA kan flykte fra endokytiske vesikler inn i cytoplasma for å nå RNA interferensmaskineriet.Videre etter intravenøs injeksjon av en enkelt dose polyetylenimin SPION siRNA nanopartikkel komplekser flocentimetrical analyse av CD11b positive og CD3 positive celler avslører en mer effektiv opptak av nanopartikler av CD11b uttrykker makrofager enn av CD3 positive celler når som helst i alle organer undersøkt. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å forberede polyetylenimine SPION's med et gjennomsnittlig datapotensial ikke høyere enn 37 millivolt og å forberede polyetylenimine SPION siRNA komplekser på lav jern til siRNA-forhold. Denne teknikken sammenligner behovet for forskere å utforske terapeutisk potensial for å målrette makrofag i dyremotorer av menneskelig sykdom som og kreft.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Eksitotoksiske Stimulering av Hjerne Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Slow-release Drug Delivery gjennom Elvax 40W til Rat Retina: Konsekvenser for behandling av kroniske betingelser

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Isolere og bruke Deler av Bovine mesenteriske arterie og vene som en biologisk metode for å teste for vasoactivity i tynntarmen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetri å måle Mouse kontraktile Trykk<em&gt; I Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; I Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro og i Vivo oppdagelse av Mitophagy i menneskelige celler, C. Elegansog mus

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

I Vivo Evaluering av brudd Callus utvikling i bein Healing i mus bruker en MRI-kompatibel Osteosynthesis enhet for musen Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...