Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo programa de desenvolvimento da China (n. º 2017YFA0205502) e nacional chave de pesquisa e a Fundação Nacional de ciências naturais da China (81772308).

Todos os métodos que envolvem animais vivos foram realizados em conformidade com o animal cuidado e usam as diretrizes da Universidade do sudeste, China.
1. preparação do PEI-SPIONs
<ol><li>
Preparação do ácido oleico-modificado SPIONs
	<ol>
<li>Dissolva FeCl3•6H2O e Filipa4•7H2O na água sob a proteção de N2.<ol>
<li>Adicione 28 g de FeCl3•6H2O e 20 g de Filipa4•7H2<...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. 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Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. 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Os macrófagos são refratários a transfect por abordagens nonviral comumente usadas, como espécie de lipídios, lipossomas catiônicos e eletroporação. Aqui nós descrevemos um método confiável e eficiente para transfect macrófagos com siRNA. Utilizando o presente protocolo, mais 90% dos macrófagos, como 264.7 pilhas (Figura 2B) e de macrófagos peritoneais de ratos18 pode ser transfected com siRNA sem deterioração significativa da viabilidade celular. Esse...

Os macrófagos são um tipo de células do sistema imune inatos distribuídos em todos os tecidos do corpo, embora em quantidades diferentes. Produzindo uma variedade de citocinas e outros mediadores, eles desempenham papéis críticos na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos a invadir, na reparação de tecidos após lesão e na manutenção da homeostase de tecido1. Devido à sua importância, os macrófagos continuamente tenham sido objecto de intensa investigação. No entanto, apesar de sua prevalência em estudos de função e regulação gênica, silenciamento de genes mediada por siRNA é menos susceptível de ter êxito em macrófagos, porque estas células — particularmente, macrófagos primários — são frequentemente difíceis de transfect. Isto pode ser atribuído a um grau relativamente elevado de toxicidade associado com abordagens de transfeccao mais bem estabelecidas que a membrana celular é quimicamente (por exemplo, com polímeros e lipídios) ou fisicamente (por exemplo, por eletroporação e armas de gene) interrompeu deixar siRNA moléculas atravessam a membrana, reduzindo assim drasticamente viabilidade de2,3 dos macrófagos. Além disso, os macrófagos são os fagócitos dedicados ricos em enzimas degradativos. Estas enzimas podem danificar a integridade do siRNA, enfraquecendo sua eficiência silencioso mesmo se siRNA gene-específico foi entregue para a célula3,4. Portanto, precisa de um sistema de entrega de siRNA macrófago-alvo eficaz proteger a integridade e a estabilidade de siRNA durante entrega4.
É cada vez mais evidente que macrófagos disfuncionais estão implicados na iniciação e progressão de certas desordens clínicas comuns como doenças auto-imunes, aterosclerose e câncer. Por este motivo, modulando a função do macrófago com, por exemplo, siRNA, tem sido a emergir como uma metodologia atraente para o tratamento destes transtornos5,6,7. Embora muito progresso tem sido feito, um grande desafio da estratégia de tratamento baseado em siRNA é a especificidade da célula pobre de siRNA sistemicamente administrado e a absorção de siRNA insuficiente pelos macrófagos, que, consequentemente, levar a efeitos colaterais indesejados. Comparado com terapêutica de ácido nucleico livre que geralmente carecem de seletividade de célula ideal e muitas vezes levam a efeitos adversos, carregado de drogas nanopartículas (NPs), devido à sua propensão espontânea de ser capturado pelo sistema reticuloendotelial, fora do alvo pode ser projetada para o direcionamento passiva de macrófagos na vivo, permitindo a maior eficácia terapêutica com efeitos colaterais mínimos8. Atual NPs explorado para a entrega de moléculas do RNA incluem nanocarriers inorgânicos e lipossomas diversos polímeros9. Entre eles, o polyethyleneimine (PEI), um tipo de polímeros cationic capazes de vinculação e condensação de ácidos nucleicos em NPs estabilizado, mostra o RNA maior fornecimento de capacidade9,10. PEI protege os ácidos nucleicos de degradação enzimática e nonenzymatic, Medeia sua transferência através da membrana celular e promove sua liberação intracelular. Embora inicialmente introduzido como um reagente de entrega de DNA, PEI foi posteriormente demonstrado ser uma plataforma atrativa para na vivo entrega siRNA, localmente ou sistemicamente9,10.
Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIONs) tem mostrado grande promessa na biomedicina, devido às suas propriedades magnéticas, biocompatibilidade, tamanho comparável aos objetos biologicamente importantes, alta proporção de superfície-área-volume e facilmente adaptável superfície para o bioagente anexo11. Por exemplo, por causa de sua utilidade potencial como um agente de contraste e rápida absorção por macrófagos, SPIONs surgiram como uma ferramenta clínica favorita para imagem de macrófagos de tecido12. Enquanto SPIONs também têm sido muito estudados como ácido nucleico entrega veículos11,13,14,15, nosso conhecimento, a literatura contém alguns relatos de SPIONs como um portador para entrega de siRNA macrófago-alvo. Para a entrega do gene por SPIONs, sua superfície geralmente é revestida com uma camada de polímeros cationic hidrofílicos na qual carregados negativamente ácidos nucleicos pode ser eletrostaticamente atraiu e amarrados. Aqui, apresentamos um método para a síntese de SPIONs cuja superfície é modificada com baixo peso molecular (10 kDa), ramificada PEI (PEI-SPIONs). Estes nanoplatforms magnéticos então são empregados para condensar siRNA, formando complexos de PEI-SPION/siRNA que permitem o transporte de siRNA para a célula. Nós razão aquela espontânea fagocitose de SPIONs pelas células do sistema reticuloendotelial16, juntamente com a forte capacidade de ligação e condensação de ácidos nucleicos por PEI, processa a PEI-SPIONs apropriado para o transporte eficiente de siRNA em macrófagos. Os dados apresentados aqui apoiar a viabilidade de silenciamento de genes PEI SPION/siRNA-mediada em macrófagos na cultura, bem como na vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

Devido ao seu papel crítico na regulação da resposta imune, os macrófagos continuamente tenham sido objecto de intensa investigação e representam um alvo terapêutico promissor em muitas doenças, como doenças auto-imunes, aterosclerose e câncer. Silenciamento de genes mediada por RNAi é uma valiosa abordagem de escolha para investigar e manipular a função de macrófagos; no entanto, o transfeccao de macrófagos com siRNA é considerado frequentemente para ser tecnicamente desafiador, e, neste momento, algumas metodologias dedicadas para a transferência de siRNA para macrófagos estão disponíveis. Aqui, apresentamos um protocolo do uso de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético polyethyleneimine-revestido (PEI-SPIONs) como um veículo para a entrega de alvo de siRNA para macrófagos. PEI-SPIONs são capazes de vinculação e completamente condensação siRNA quando a relação de peso de Fe: siRNA atinge 4 e acima. In vitro, essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA em macrófagos primários, bem como para a linha de celular de macrófagos, como 264.7 crus, sem comprometer viabilidade celular na dose ideal para transfeccao, e, em última análise, eles induzem silenciamento de genes mediada por siRNA alvo. Além de ser usado para em vitro transfeccao siRNA, PEI-SPIONs são também uma ferramenta promissora para a entrega de siRNA para macrófagos na vivo. Tendo em conta as suas características combinadas de propriedade magnética e silenciamento capacidade, sistemicamente administrado PEI-SPION/siRNA partículas são esperadas não só para modular a função de macrófagos, mas também para ativar macrófagos para ser fotografado e rastreado. Em essência, PEI-SPIONs representam uma plataforma nonviral simples, segura e eficaz para a entrega de siRNA para macrófagos tanto in vitro e in vivo.

O tamanho e a zeta potencial de PEI-SPIONs preparado com este protocolo foram na faixa de 29-48 nm (índice de polidispersividade: 0.12 - 0,23) e 30-48 mV, respectivamente. Eles estavam estáveis em água a 4 ° C por mais de 12 meses sem agregação óbvia. Para avaliar sua capacidade de vinculação de siRNA, PEI-SPIONs foram misturadas com siRNA em várias relações de peso de Fe: siRNA. A Figura 1 mostra que quando a relação de peso de Fe: siRNA atinge...

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Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Essa medida pode ajudar a responder a perguntas-chave. No campo da humanologia. Essa resposta na função de macrófagos sob o fim fisiológico de condições patológicas.A principal vantagem desta técnica é que a polietileneimina revestida pode en vitro eficientemente sem comprometer a célula. Sob doses ideais. As implicações dessa técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico de muitos distúrbios inflamatórios crônicos e cânceres.Onde os macrófagos desempenham um papel essencial na patogênese. Demonstrando o procedimento será Na Jia. Um estudante de pós-graduação do meu laboratório.E Kaixuan Wang, um estudante de pós-graduação do laboratório do Dr. Xiaohua. Para preparar nanopartículas de óxido de ferro super paramagnética modificadas modificadas ou spion primeiro adicionar 28 gramas de hexahidrato de cloreto de faraó. E 20 gramas faraós autoato heptahydrate a um béquer contendo 80 mililitros de água deionizada.E use um conduíte de vidro para introduzir nitrogênio na solução. Mexendo até que a matéria sólida tenha dissolvido. Aqueça a mistura de reação a 72 graus Celsius com agitação a 800 rotações por minuto.E adicione 40 mililitros de 28% de água de amônia ao béquer. Depois de cinco minutos adicione nove mililitros de ácido aliado gota sábia. E mantenha a mistura a 72 graus Celsius por três horas com agitação contínua.No final da incubação esfrie a solução resultante para a temperatura ambiente. E precipitar a mistura através da separação magnética de acordo com os protocolos padrão. Em seguida, lave o SPION contendo precipitado três vezes com álcool etílico absoluto.E asperse o precipitado em 100 mililitros de n-hexano. Para preparar o ácido acrílico modificado, o SPION's de ácido acrílico adiciona 800 miligramas do spion modificado do ácido aliado. Dispersados em 200 mililitros de n-hexano e 400 miligramas de ácido acrílico dimercapto dispersados em 200 mililitros de acetona em um frasco de três pescoços em um banho de água a 60 graus Celsius.Em seguida, adicione 200 microliters de trietilamina gota sábia ao frasco com agitação a 1000 rotações por minuto e refluxo. Um precipitado preto pode ser obtido por separação magnética após cinco horas. Em seguida, use hidróxido de tetrametamônio para ajustar o pH da solução para dispersão homogênea do SPION hidrofílico em água desionizada.Spion revestido de polietileneimina degenerada adicionam o ácido acrílico modificado solução coloidal do SPION modificada em uma solução de polietileneimina de 10 quilodalton. Em um frasco de três pescoços de 500 mililitros sob agitação mecânica a 1000 rotações por minuto durante duas horas. No final da incubação adicione a solução resultante a um tubo de ultra filtração com um peso molecular cortado de 100 kilodaltons e um conteúdo de 15 mililitros.Subsutilize a amostra até que a solução restante atinja um volume de um mililitro. Adicione água deionizada à solução para trazer o volume de volta para 15 mililitros. E centrafuse e reidratar a solução mais dez vezes como acabou de demonstrar.Em seguida, filtre a solução através de um filtro de 22 mícrons para armazenamento a quatro graus Celsius. Para preparar as nanopartículas siRNA primeiro adicione três microlitradores de 20 soluções de siRNA micromolar recém-preparadas para cinco tubos microcentroafusados gratuitos da RNA. E adicione 0, 8, 1,6, 3,2 e 6,4 microgramas de SPION de polietileneimina aos tubos rotulados zero, um, dois, quatro e oito, respectivamente.Depois de misturar com tubos suaves, incubar as amostras por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que os complexos de siRNA spion de polietileneimina se formem. E prepare um gel de 3% de agarose com a ágarose da pureza. No final da incubação adicione um microliter de 6X buffer de carregamento de DNA por cinco microliters de amostra para cada tubo e misture cuidadosamente.Em seguida, carregue todas as amostras no gel. E executar eletroforese a cinco volts por centímetro. Até que o corante azul bromofenol migra dois terços do comprimento no gel.Um dia antes da transfecção lavar um micrófago de camundongos como a cultura celular RAW264.7 com PBS. E trate as células com um mililitro de 25% de trippsina por cinco a dez minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Quando a maioria das células se separaram.Inativar a trippsina com cinco mililitros de DMEN completo. Em seguida, pippete a solução várias vezes para dispersar quaisquer aglomerados celulares. Transfira a suspensão celular para um tubo de conackel de 15 mililitros estéril para centrifugação.Em seguida, suspenda novamente as células em cinco mililitros de DMEN completo fresco para contar. Diluir as células para uma concentração de 4,5 vezes dez para a quarta células por mililitro de concentração completa de DMEN. E adicione dois mililitros de médio a cada poço de uma placa de seis poços para uma incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular.No dia seguinte, prepare a razão apropriada de nanopartículas de siRNA spion de polietileneimina em um tubo de microcentrifuge de fluxo de RNA de 1,5 mililitro com mistura suave como apenas demonstrado. E adicione o volume apropriado de polietileneimina SPION siRNA nanopartícula complexa a cada poço que foi substituído por um mililitro de meio fresco. Prepare os complexos spion si de polietileneimina.neste caso, muitos mais meses de SPION de polietileneimina podem ser usados assim minimizando sua toxicidade potencial. Em seguida, gire a placa cuidadosamente para obter uma distribuição uniforme das nanopartículas através das partes inferiores do poço. Devolva a placa à incubadora de cultura celular até a atualização celular subsequente ou a análise da deficiência de knockdown genético.SPION de polietileneimina com potencial zeta de 30,5 e 37 milivolts não apresentam uma toxicidade cito aparente em concentrações de até 30 microgramas de ferro por mililitro. Que é cerca de duas vezes a contratação do que a concentração normalmente usada para transfecção celular. O potencial zeta da POLIetileneimina SPION de 48 milivolts, no entanto, são tóxicos.Mesmo na dose mais baixa examinada. Como analisado pela citometria de fluxo, mais de 90% das células podem ser transfeinadas com complexos de siRNA de polietileneimina fluorescente a 15 microgramas de ferro por mililitro. A avaliação dos efeitos das concentrações de siRNA de polietileneimina spion na internalização celular esmagando manchas azuis revela uma coloração minimamente detectável a 7,5 microgramas de ferro por mililitro.Mas manchas claramente visíveis a 15 microgramas de ferro por mililitro que não aumentam em concentrações mais altas de ferro provavelmente devido à absorção de saturação de saturação de absorção de siRNA de polietileneimina SPION. Macrófagos peritoneais transfectados com siRNA específico de polietileneimina SPION apresentam uma diminuição significativa nos níveis de mRNA de targe em comparação com siRNA não específica. Sugerindo que o siRNA pode escapar de vesículas endocíticas para o citoplasma para alcançar as máquinas de interferência de RNA.Além disso, após a injeção intravenosa de uma única dose de polietileneimina SPION siRNA nanopartículas flocentimétricas análise flocentimétrica de células positivas CD11b e CD3 positivo revela uma absorção mais eficiente das nanopartículas pelo CD11b expressando macrófagos do que por células positivas CD3 a qualquer momento em todos os órgãos examinados. Ao tentar este procedimento é importante lembrar-se de preparar os SPIONs de polietileneimina com um potencial médio de dados não superior a 37 milvolts e preparar os complexos de siRNA SPION de polietileneimina nas relações de ferro baixo para siRNA. Essa técnica compara a necessidade de os pesquisadores explorarem o potencial terapêutico de segmentação do macrófago em motores animais de doenças humanas, como e câncer.

Research

JoVE Journal

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