Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (81772308) и Национальный исследовательский ключ и Программа развития Китая (№ 2017YFA0205502).

Все методы, которые были проведены с участием живых животных в соответствии с животное уход и использовать руководящие принципы Юго-Восточный университет, Китай.
1. Подготовка Пей SPIONs
<ol><li>
Подготовка олеиновая кислота модифицированных SPIONs
	<ol>
<li>Растворите FeCl<su...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

Макрофаги являются тугоплавкие transfect часто используемые синцитиального подходы, например, электропорация, Катионный липосомы и липидов видов. Здесь мы описали надежный и эффективный метод для transfect макрофагов с siRNA. Используя настоящий Протокол, свыше 90% Макрофаг как RAW 264.7 клеток (<strong cl...

Макрофаги являются тип innate иммунных клеток, распространен во всех тканях организма, хотя и в разных количествах. Производя различные цитокины и других посредников, они играют важнейшую роль в принимающей обороны против вторжения патогенных микроорганизмов, в ткани ремонт после травмы и в поддержании гомеостаза ткани1. Из-за их важности макрофаги непрерывно были предметом интенсивных исследований. Однако, несмотря на его распространенности в ген регулирования и исследования функции, малых интерферирующих РНК опосредованной генов меньше шансов на успех в макрофагах, потому что эти клетки — в частности, первичного макрофаги — зачастую трудно transfect. Это можно объяснить сравнительно высокой степени токсичности связанные с наиболее устоявшихся трансфекции подходов, в которых клеточной мембраны является химически (например, полимеров и липидами) или физически (например, путем электропорации и Джин пушек) нарушается позволить siRNA молекул через мембрану, тем самым значительно снижая макрофаги жизнеспособности2,3. Кроме того макрофаги, посвященный фагоцитов богаты деструктивные ферментов. Эти ферменты могут нарушить целостность siRNA, ослабляет эффективность глушителя, даже если ген специфического siRNA был доставлен в ячейке3,4. Таким образом эффективный siRNA Макрофаг целевой системы доставки необходимо защищать целостность и стабильность малых интерферирующих РНК во время доставки4.
Становится все более очевидным, что неблагополучных макрофаги замешаны в инициации и прогрессирования некоторых общих клинических расстройств как аутоиммунных заболеваний, атеросклероза и рак. По этой причине, модулирует функции макрофагов с, например, siRNA формируется как привлекательный методологию для лечения этих расстройств по5,6,7. Хотя был достигнут значительный прогресс, главной задачей стратегии на основе малых интерферирующих РНК лечения является бедным ячейки специфика системно управляемых siRNA и недостаточно siRNA поглощение макрофагами, которые соответственно приводят к нежелательным побочным эффектам. По сравнению с свободной нуклеиновые кислоты терапевтов, которые обычно не имеют оптимальное ячейки избирательности и часто приводят к негативным последствиям, загруженных наркотиков наночастиц (NPs), ввиду их спонтанной склонность быть захвачен ретикулоэндотелиальной системы,-цели могут быть спроектированы для пассивной ориентации макрофагов в естественных условиях, позволяя для улучшения терапевтической эффективности с минимальными побочными эффектами8. Текущий NPs, изучены для доставки молекул РНК включают неорганических nanocarriers, различные липосомы и полимеров9. Среди них полиэтиленимина (PEI), тип катионных полимеров, способных привязки и конденсации нуклеиновых кислот в стабилизированное NPs, показывает высокий РНК, обеспечивая потенциал9,10. PEI защищает нуклеиновые кислоты от ферментативного и nonenzymatic деградации, является посредником при их передаче через клеточную мембрану и способствует их внутриклеточного релиз. Хотя первоначально введено как реагент доставки ДНК, пей впоследствии был продемонстрирован быть привлекательной платформой для в естественных условиях доставки siRNA, либо локально или системно9,10.
Наночастицы суперпарамагнетическим оксида железа (SPIONs) показали большие перспективы в биомедицине, вследствие их магнитные свойства, биосовместимость, сопоставимого размера биологически важных объектов, высокий коэффициент площадь поверхности и объем и легко адаптируется поверхностью для bioagent крепления11. Например из-за их потенциальной полезности в качестве контрастного вещества и быстрое поглощение макрофагами, SPIONs появились как любимый клинический инструмент для изображения ткани макрофагами12. В то время как SPIONs также были широко изучены как нуклеиновые кислоты доставки транспортных средств11,13,14,15, к нашему знанию, литература содержит несколько сообщений о SPIONs как носитель для Макрофаг целевой siRNA доставки. Для доставки генов, SPIONs их поверхность обычно покрыты слоем гидрофильные катионных полимеров, на которые отрицательно заряженных нуклеиновые кислоты может быть электростатически привлекают и привязал. Здесь мы представляем метод синтеза SPIONs, поверхность которых изменяется с низким молекулярным весом (10 кДа), разветвленные Пей (пей-SPIONs). Затем эти магнитные nanoplatforms заняты уплотнить siRNA, образуя комплексы Пей-SPION/siRNA, позволяющие транспорта малых интерферирующих РНК в клетку. Мы причина что спонтанное фагоцитоза SPIONs клеток ретикулоэндотелиальной системы16, в сочетании с сильной способности привязки и конденсации нуклеиновых кислот, пей, оказывает Пей-SPIONs подходит для эффективной перевозки малых интерферирующих РНК в макрофаги. Представленные здесь данные поддерживают возможности подавления экспрессии гена Пей-SPION/малых интерферирующих РНК опосредованной в макрофагах в культуре, а также в естественных условиях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

Из-за их решающую роль в регулировании иммунной реакции Макрофаги непрерывно были предметом интенсивных исследований и представляют собой многообещающие терапевтические целевой многих расстройств, таких как аутоиммунных заболеваний, атеросклероза и рак. Сайленсинга генов, опосредованного системой РНК-интерференции является ценным подход выбора зонд и манипулировать функции макрофагов; Однако transfection макрофагов с siRNA часто считается чтобы быть технически сложным, и в настоящее время, доступны несколько методик, посвященный siRNA передачи макрофагов. Здесь мы представляем протокол использования наночастиц полиэтиленимина покрытием суперпарамагнетическим оксида железа (пей-SPIONs) в качестве транспортного средства для доставки целевых интерферирующей РНК макрофагов. Пей-SPIONs способны привязки и полностью конденсации siRNA, когда массовая доля Fe: siRNA достигает 4 и выше. В пробирке, эти наночастицы могут эффективно поставлять малых интерферирующих РНК в первичных макрофагов, а также в Макрофаг как RAW 264.7 клеток линии, без ущерба для жизнеспособности клеток при оптимальной дозе для transfection, и, в конечном счете, они вызывают малых интерферирующих РНК опосредованной целевой сайленсинга генов. Помимо используется для в vitro трансфекции siRNA, пей-SPIONs также являются перспективным инструментом для доставки siRNA макрофагов в естественных условиях. С учетом его комбинированных особенностей магнитные свойства и способность заставлять замолчать гена системно управляемых Пей-SPION/siRNA частицы, как ожидается, не только чтобы модулировать функции макрофагов, но и для включения макрофаги образы и отслеживаются. По сути, пей-SPIONs представляют собой простой, безопасный и эффективный синцитиального платформу для доставки siRNA макрофагов в пробирке и в естественных условиях.

Размер и Зета потенциал Пей-SPIONs, приготовленные этот протокол были в диапазоне от 29-48 Нм (полиизопрена индекс: 0.12 - 0,23) и 30-48 м, соответственно. Они были стабильными в воде при температуре 4 ° C в течение 12 месяцев без очевидных агрегации. Чтобы оценить их siRNA привязки способ...

Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Мы описываем метод использования полиэтиленимина (PEI)-покрытием суперпарамагнетическим оксида железа наночастицы для transfecting макрофагов с siRNA. Эти наночастицы могут эффективно поставлять малых интерферирующих РНК к макрофагов в пробирке и в естественных условиях и молчание экспрессии генов цели.

Наночастицы полиэтиленимина покрытием оксида железа как средство для доставки малые интерферирующие РНК макрофаги In Vitro и In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Эта мера может помочь ответить на ключевые вопросы. В области гуманизма. Этот ответ в функции макрофагов при физиологическом конце патологических состояний.Основным преимуществом этой техники является то, что полиэтилеймин покрытием может эффективно en vitro без ущерба для клеток. При оптимальных дозах. Последствия этого метода распространяются на терапию и диагностику многих хронических воспалительных расстройств и рака.Где макрофаги играют важную роль в патогенеза. Демонстрация процедуры будет Na Jia. Аспирант из моей лаборатории.И Кайсуань Ван аспирант лаборатории доктора Сяохуа. Для приготовления эллиновой кислоты модифицированные супер парамагнитные наночастицы оксида железа или первый СПБИОН добавить 28 граммов хлорида хлорида гексагидрата. И 20 граммов фараонов самостоятельного гептагидрата в стакан, содержащий 80 миллилитров деионизированной воды.И использовать стеклянный канал для введения азота в раствор. Перемешивание до тех пор, пока твердая материя не растворится. Нагрейте реакционной смеси до 72 градусов по Цельсию с перемешиванием при 800 вращениях в минуту.И добавить 40 миллилитров 28%аммиачной воды в стакан. Через пять минут добавить девять миллилитров эллиновой кислоты падение мудрым. И поддерживать смесь при 72 градусах по Цельсию в течение трех часов с непрерывным перемешиванием.В конце инкубации охладить полученный раствор до комнатной температуры. И осаждать смесь через магнитное разделение в соответствии со стандартными протоколами. Затем мыть SPION содержащие осадки в три раза с абсолютным этилового спирта.И asperse осадков в 100 миллилитров n-hexane. Для подготовки димеркапто акриловой кислоты модифицированные SPION добавить 800 миллиграммов эллиновой кислоты модифицированных SPION's. Рассеянные в 200 миллилитров n-hexane и 400 миллиграммов димеркапто акриловой кислоты рассредоточены в 200 миллилитров ацетона в три шеи колбу в водяной бане при 60 градусов по Цельсию.Далее добавить 200 микролитров триэтиламина падение мудрым в колбу с перемешиванием на 1000 вращений в минуту и рефлюксирования. Черный осадок может быть получен путем магнитного разделения через пять часов. Затем используйте тетраметиламмоний гидроксида для регулировки рН раствора для однородного рассеивания гидрофильных SPION в деионизированной воде.Дегенеративная полиэтиленовая покрытие SPION добавить димеркапто акриловой кислоты модифицированного коллоидного раствора SPION падение мудрым в 10 килодальтон полиэтиленового раствора. В 500 миллилитров три шеи колбу под механическим перемешиванием при 1000 вращений в минуту в течение двух часов. В конце инкубации добавьте полученный раствор в ультрафильтральную трубку с молекулярной массой, отрезанной от 100 килодальтонов и содержанием 15 миллилитров.Центрафуз образец до тех пор, пока оставшийся раствор не достигнет одного миллилитрового объема. Добавьте деионизированную воду в раствор, чтобы вернуть объем до 15 миллилитров. И centrafuse и регидратировать решение еще в десять раз, как только что продемонстрировали.Затем отфильтруйте раствор через фильтр емкостью 22 микрона для хранения при четырех градусах Цельсия. Для подготовки наночастиц siRNA сначала добавьте три микролитров свежеприготовленных 20 растворов микромолярной сирны в пять свободных микроцентроафированных труб РНК. И добавить 0, 8, 1,6, 3,2 и 6,4 микрограмма полиэтиленемин SPION в трубки помечены ноль, один, два, четыре и восемь соответственно.После смешивания с нежным пипетки, инкубировать образцы в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы полиэтилеймин SPION siRNA комплексов для формирования. И подготовить три процента агарозный гель с I чистоты агарозы. В конце инкубации добавьте один микролитер буфера загрузки 6X на пять микролитров образца к каждой трубке и тщательно перемешайте.Затем загрузите все образцы на гель. И запустить электрофорез на пять вольт на сантиметр. До бромофено голубой краситель мигрирует две трети длины на гель.За день до трансфекции мыть микрофагов мыши, как RAW264.7 клеточной культуры с PBS. И лечить клетки с одним миллилитром 25%трипсина в течение пяти-десяти минут при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентном инкубаторе двуокиси углерода. Когда большинство клеток отсоединились.Инактивировать трипсин с пятью миллилитров полного DMEN. Затем pippete решение несколько раз, чтобы разогнать любые кластеры клеток. Перенесите подвеску клетки в стерильную 15-миллилитровую конакльную трубку для центрифугации.Затем повторно приостановить клетки в пять миллилитров свежего полного DMEN для подсчета. Разбавить клетки в 4,5 раза десять до четвертого клетки на миллилитр полной концентрации DMEN. И добавить два миллилитров среднего к каждому хорошо из шести пластины хорошо в течение 24 часов инкубации в инкубаторе культуры клеток.На следующий день подготовить соответствующее соотношение полиэтилеймин SPION siRNA наночастиц в 1,5 миллилитров РНК поток микроцентрифуг трубки с нежным смешивания, как только что продемонстрировано. И добавьте соответствующий объем полиэтиленового комплекса SIRNA siRNA к каждой колодец, который был заменен на один миллилитр свежей среды. Подготовка полиэтиленовых комплексов SPION si.в этом случае еще много месяцев полиэтилена SPION могут быть использованы Таким образом, минимизируя их потенциальную токсичность. Затем тщательно закружить пластину для достижения равномерного распределения наночастиц по днищам хорошо. Верните пластину в инкубатор клеточной культуры до последующего клеточного обновления или анализа дефицита нокдауна генов.Политетилеймин СПИОН с потенциалом зеты 30,5 и 37 милливольт не обладают очевидной цитотоксичности в концентрациях до 30 микрограммов железа на миллилитр. Что примерно в два раза больше, чем концентрация, обычно используемая для трансфекции клеток. Polyethyleneimine SPION в zeta потенциал 48 милливольт однако являются токсичными.Даже при самой низкой дозе обследовано. Как анализируется цитометрии потока, более 90% клеток могут быть трансфицированы флуоресцентно помечены полиэтиленовые комплексы SPION siRNA на 15 микрограммов железа на миллилитр. Оценка влияния полиэтиленовых концентраций SPION siRNA на клеточной интернализации путем дробления синего окрашивания показывает минимально обнаруживаемое окрашивание на 7,5 микрограмма железа на миллилитр.Но хорошо видны пятна на 15 микрограмм железа на миллилитр, которые не увеличиваются при более высоких концентрациях железа, вероятно, из-за полиэтилемин SPION siRNA поглощения насыщения. Перитонеальные макрофаги, трансфицированные полиэтиленом SPION в укрывательство конкретных siRNA экспонат значительное снижение уровня targe mRNA по сравнению с неспецифической siRNA. Предполагая, что siRNA может вырваться из эндоцитических пузырьков в цитоплазму, чтобы достичь РНК-интерференционного механизма.Далее после внутривенного введения разовой дозы полиэтилена SPION siRNA наночастиц комплексов flocentimetrical анализ CD11b положительных и CD3 положительных клеток показывает более эффективное поглощение наночастиц CD11b, выражающий макрофаги, чем CD3 положительные клетки в любой момент времени во всех исследованных органах. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы подготовить полиэтиленемин SPION со средним потенциалом данных не выше 37 милливольт и подготовить полиэтиленемин SPION siRNA комплексов на низких коэффициентов железа к siRNA. Этот метод сравнивает потребность для исследователей исследовать терапевтический потенциал пристреливания макрофагов в животных двигателях людских заболеваний such as и рак.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Стратегии для определения де Ново Мутации в общих расстройств, таких как аутизм и шизофрения

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Экзайтотоксическим Стимуляция мозга Microslices как<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель инсульта

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Замедленное высвобождение доставка лекарств через Elvax 40 Вт в сетчатке крыс: последствия для лечения хронических условий

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Изоляция и Использование разделов крупного рогатого брыжеечной артерии и вены, как биологических испытаний для тестирования для вазоактивности в тонком кишечнике

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Внутриматочная телеметрии измерить мышь сократительной давления<em&gt; В Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Неонатальная мышь Метод Cochlear Explant Technique как<em&gt; In Vitro</em&gt; Инструмент скрининга в исследованиях слуха

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro и In Vivo обнаружения Mitophagy в клетки человека и C. Elegans, мышей

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

В естественных условиях Оценка развития каллуса перелом кости Исцеление у мышей с использованием МРТ совместимое устройство остеосинтеза для мыши бедренной

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...