Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81772308) y el nacional de investigación clave y programa de desarrollo de China (Nº 2017YFA0205502).

Todos los métodos que implican animales vivos fueron realizados según el animal cuidado y utilizan las pautas de la Universidad del sudeste, China.
1. preparación de PEI-SPIONs
<ol><li>
Preparación de SPIONs modificado con ácido oleico
	<ol>
<li>Disolver FECLAS3•6H2O y FeSO4•7H2O en el agua bajo la protección de N2.<ol>
<li>Añadir 28 g de FECLAS3•6H2O y 20 g de FeSO4•7H<sub...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. 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S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

Los macrófagos son refractarios a transfectar por enfoques nonviral utilizados, tales como especies de lípidos, liposomas catiónicos y electroporación. Aquí describimos un método confiable y eficiente para transfectar macrófagos con ARNsi. Mediante el presente Protocolo, sobre 90% de macrófagos RAW 264.7 células (figura 2B) y de los macrófagos peritoneales de rata18 puede ser transfectado con siRNA sin deterioro significativo de la viabilidad celular. Este m...

Los macrófagos son un tipo de células inmunes innatas distribuidos en todos los tejidos del cuerpo, aunque en diferentes cantidades. Produciendo una variedad de citoquinas y otros mediadores, que desempeñan papeles críticos en la defensa del huésped contra los invasores patógenos microbianos, en reparación de los tejidos posterior a la lesión y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido1. Debido a su importancia, los macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación. Sin embargo, a pesar de su prevalencia en estudios de la función y Regulación génica, silenciamiento génico mediado por siRNA es menos probable que tenga éxito en macrófagos porque estas células — particularmente, los macrófagos primarios — son a menudo difíciles transfectar. Esto se puede atribuir a un relativamente alto grado de toxicidad asociado con enfoques de transfección más bien establecidos en la cual la membrana celular es químicamente (por ejemplo, con polímeros y lípidos) o físicamente (p. ej., por electroporación y pistolas de genes) interrumpen dejó siRNA moléculas cruzan la membrana, reduciendo así drásticamente viabilidad2,3 de macrófagos. Además, los macrófagos son los fagocitos dedicados ricos en enzimas degradativas. Estas enzimas pueden dañar la integridad de los siRNA, debilitando su eficacia silenciar aunque específicos de genes siRNA se ha entregado en la célula3,4. Por lo tanto, un sistema de envío eficaz orientada a macrófago siRNA necesita proteger la integridad y estabilidad del siRNA durante el plazo de expedición4.
Es cada vez más evidente que los macrófagos disfuncionales están implicados en la iniciación y la progresión de ciertos trastornos clínicos comunes como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Por esta razón, modulando la función del macrófago con, por ejemplo, siRNA, ha ido surgiendo como una metodología atractiva para el tratamiento de estos trastornos5,6,7. Aunque se ha progresado mucho, un gran reto de la estrategia de tratamiento basada en el siRNA es la especificidad celular pobre de siRNA sistémico administrado y la siRNA insuficiente captación por los macrófagos, que por lo tanto dar lugar a efectos secundarios indeseados. En comparación con la terapéutica de ácido nucleico libre que generalmente carecen de selectividad óptima de la célula y a menudo conducen a efectos adversos, cargado de droga nanopartículas (NPs), debido a su propensión espontánea de ser capturado por el sistema reticuloendotelial, fuera del objetivo puede diseñarse para apuntar pasivo a macrófagos en vivo, lo que permite mayor eficacia terapéutica con efectos secundarios mínimos8. NPs actuales para la entrega de las moléculas de ARN son nanocarriers inorgánicos y liposomas varios polímeros9. Entre ellos, polietilamina (PEI), un tipo de polímeros catiónicos capaces de atar y condensación de los ácidos nucleicos en NPs estabilizados, muestra el ARN más alta entrega capacidad9,10. PEI protege los ácidos nucleicos de la degradación enzimática y nonenzymatic media a su transferencia a través de la membrana celular y promueve su liberación intracelular. Aunque inicialmente introducido como un reactivo de entrega ADN, PEI fue demostrado posteriormente para ser una plataforma atractiva para en vivo siRNA entrega, ya sea local o sistémicamente9,10.
Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIONs) han demostrado gran promesa en biomedicina, debido a sus propiedades magnéticas, biocompatibilidad, tamaño comparable a objetos biológicamente importantes, alta relación superficie-área-volumen y se adapta fácilmente superficie para bioterrorismo anexo11. Por ejemplo, debido a su utilidad potencial como un agente de contraste y una rápida captación por los macrófagos, SPIONs han surgido como una herramienta clínica favorita a imagen de los macrófagos de tejido12. SPIONs también se han estudiado ampliamente como ácido nucleico entrega vehículos11,13,14,15, a nuestro conocimiento, la literatura contiene algunos informes de SPIONs como un portador para el entrega de siRNA dirigidos a macrófagos. Para la entrega del gene de SPIONs, su superficie es generalmente cubierta con una capa de polímeros catiónicos hidrofílicos en que cargado negativamente los ácidos nucleicos puede ser electrostático atraídos y atados. Aquí, presentamos un método para sintetizar SPIONs cuya superficie se modifica con bajo peso molecular (10 kDa), ramificado PEI (PEI-SPIONs). Estos nanoplatforms magnéticas se emplean entonces para condensar siRNA, formando complejos de PEI-SPION/siRNA que permiten transporte de siRNA en las células. Razón fagocitosis espontánea de SPIONs por las células del sistema reticuloendotelial16, junto con la capacidad fuerte de la Unión y condensación de los ácidos nucleicos por PEI, hace conveniente para el transporte eficiente de siRNA en PEI-SPIONs macrófagos. Los datos aquí presentados apoyan la viabilidad de silenciamiento del gen PEI SPION/siRNA-mediada por macrófagos en cultivo como en vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

Debido a su papel fundamental en la regulación de la respuesta inmune, macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación y representan una prometedora diana terapéutica en muchos trastornos, como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Silenciamiento génico mediado por RNAi es un valioso enfoque de elección para probar y manipular la función del macrófago; sin embargo, la transfección de macrófagos con siRNA se considera a menudo ser técnicamente difícil, y, en la actualidad, existen metodologías pocos dedicados a la transferencia de siRNA a macrófagos. Aquí, presentamos un protocolo del uso de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético revestido polietilamina (PEI-SPIONs) como un vehículo para la entrega específica de siRNA a los macrófagos. PEI-SPIONs son capaces de atascamiento y condensación completamente siRNA cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y arriba. In vitro, estas nanopartículas pueden brindar de manera eficiente siRNA primarios macrófagos, así como de la línea celular RAW 264.7 de macrófago-como, sin comprometer viabilidad celular en la dosis óptima para la transfección, y, en última instancia, inducen objetivo mediado por siRNA silenciamiento génico. Además de ser utilizados para la transfección en vitro siRNA, PEI-SPIONs son también una herramienta prometedora para la entrega de siRNA a macrófagos en vivo. Teniendo en cuenta sus características combinadas de propiedades magnéticas y la capacidad de silenciamiento génico, sistémico administradas partículas PEI-SPION/siRNA se espera que para modular la función de macrófagos, pero también para activar macrófagos ser fotografiada y seguimiento. En esencia, PEI-SPIONs representan una plataforma sencilla, segura y eficaz nonviral para entrega de siRNA a macrófagos in vitro e in vivo.

El tamaño y la zeta potencial de PEI-SPIONs preparado con este protocolo estaban en la gama de 29-48 nm (índice de polidispersidad: 0.12 - 0,23) y 30-48 MT, respectivamente. Eran estables en el agua a 4 ° C por más de 12 meses sin evidente agregación. Para evaluar su siRNA vinculante capacidad, PEI-SPIONs se mezclaron con siRNA en diferentes proporciones de peso de Fe: siRNA. La figura 1 muestra que cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y su...

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Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.

Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave. En el campo de la humanología. Esa respuesta en la función de los macrófagos bajo el fin fisiológico de las condiciones patológicas.La principal ventaja de esta técnica es que la polietilenimina recubierta puede en vitro eficientemente sin comprometer la célula. Bajo dosis óptimas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de muchos trastornos inflamatorios crónicos y cánceres.Donde los macrófagos juegan un papel esencial en la patogénesis. Demostrar el procedimiento será Na Jia. Un estudiante graduado de mi laboratorio.Y Kaixuan Wang un estudiante graduado del laboratorio del Dr.Xiaohua. Para preparar nanopartículas de óxido de hierro súper paramagnéticas modificadas por ácido allí, o las primeras de SPION añadir 28 gramos de cloruro de pharas hexahidrato. Y 20 gramos de heptahidrato autoate pharas a un vaso de precipitados que contiene 80 mililitros de agua desionizada.Y utilice un conducto de vidrio para introducir nitrógeno en la solución. Revolviendo hasta que la materia sólida se haya disuelto. Calienta la mezcla de reacción a 72 grados Celsius con agitación a 800 rotaciones por minuto.Y añadir 40 mililitros de 28% de agua de amoníaco al vaso de precipitados. Después de cinco minutos añadir nueve mililitros de ácido allílico gota sabia. Y mantener la mezcla a 72 grados Centígrados durante tres horas con agitación continua.Al final de la incubación enfriar la solución resultante a temperatura ambiente. Y precipitar la mezcla a través de la separación magnética de acuerdo con los protocolos estándar. A continuación, lave el SPION que contenga precipitado tres veces con alcohol etílico absoluto.Y aspers el precipitado en 100 mililitros de n-hexano. Para preparar el ácido acrílico dimercapto modificado SPION añadir 800 miligramos del ácido allí modificado SPION. Dispersos en 200 mililitros de n-hexano y 400 miligramos de dimercapto ácido acrílico dispersos en 200 mililitros de acetona en un matraz de tres cuellos en un baño de agua a 60 grados centígrados.A continuación, añadir 200 microlitros de trietilamina gota sabia al matraz con agitación a 1000 rotaciones por minuto y reflujo. Un precipitado negro se puede obtener por separación magnética después de cinco horas. A continuación, utilice hidróxido de tetrametilammonio para ajustar el pH de la solución para dispersos homogéneos de los SPION hidrófilos en agua desionizada.La polietilenimina degenerada recubierta de SPION añade el ácido acrílico dimercapto modificado la solución coloidal de SPION caer sabiamente en una solución de polietilenimina de 10 kilodalton. En un matraz de tres cuellos de 500 mililitros bajo agitación mecánica a 1000 rotaciones por minuto durante dos horas. Al final de la incubación añadir la solución resultante a un tubo de ultrafiltración con un peso molecular cortado de 100 kilodaltones y un contenido de 15 mililitros.Centra la muestra hasta que la solución restante alcance un volumen de un mililitro. Añadir agua desionizada a la solución para devolver el volumen a 15 mililitros. Y centra y rehidrata la solución diez veces más como se acaba de demostrar.A continuación, filtre la solución a través de un filtro de 22 micras para almacenarla a cuatro grados centígrados. Para preparar primero las nanopartículas de siRNA agregue tres microlitros de 20 soluciones de siRNA micromolar recién preparadas a cinco tubos de microcentroafusión libres de ARN etiquetado. Y agregue 0, 8, 1.6, 3.2 y 6.4 microgramos de polietilenimina SPION a tubos etiquetados con cero, uno, dos, cuatro y ocho respectivamente.Después de mezclar con pipeteo suave, incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de siRNA de polietileno SPION. Y prepara un gel de agarosa del tres por ciento con agarosa de pureza. Al final de la incubación añadir un microlitro de 6X Tampón de carga de ADN por cinco microlitros de muestra a cada tubo y mezclar cuidadosamente.A continuación, cargue todas las muestras en el gel. Y ejecuta electroforesis a cinco voltios por centímetro. Hasta que el colorante azul bromofenol migra dos tercios de la longitud del gel.Un día antes de la transfección lavar un microfago de ratón como RAW264.7 cultivo celular con PBS. Y tratar las células con un mililitro de 25% de trippsina durante cinco a diez minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono cinco por ciento. Cuando la mayoría de las células se han desprendido.Inactivar la trippsina con cinco mililitros de DMEN completo. A continuación, pipte la solución varias veces para dispersar cualquier clúster de celdas. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros de conackel para centrifugación.Luego re suspenda las células en cinco mililitros de DMEN completo fresco para contar. Diluir las células a una 4,5 veces diez a las cuartas células por mililitro de concentración completa de DMEN. Y añadir dos mililitros de medio a cada pozo de un plato de seis pozos para una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular.Al día siguiente preparar la proporción adecuada de nanopartículas de siRNA de polietilenimina SPION en un tubo de microcentrífuga de flujo de ARN de 1,5 mililitros con mezcla suave como se acaba de demostrar. Y añadir el volumen adecuado de polietilenimina SPION siRNA complejo de nanopartículas a cada pozo que ha sido reemplazado por un mililitro de medio fresco. Preparar complejos de polietilenimina SPION si.en este caso se pueden utilizar muchos más meses de polietilenimina SPION minimizando así su toxicidad potencial. A continuación, gire la placa cuidadosamente para lograr una distribución uniforme de las nanopartículas a través de los fondos de los pozos. Devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular hasta que se actualice la actualización celular posterior o se anule el análisis de deficiencia de desencamiento genético.Los SPION de polietilenimina con un potencial zeta de 30,5 y 37 milivoltios no presentan una toxicidad aparente del cito a concentraciones de hasta 30 microgramos de hierro por mililitro. Que es aproximadamente dos veces contratada que la concentración normalmente utilizada para la transfección celular. El potencial zeta de polietilenimina SPION de 48 milivoltios sin embargo son tóxicos.Incluso a la dosis más baja examinada. Según lo analizado por la citometría de flujo, más del 90% de las células pueden ser transfectadas con complejos de siRNA SPION de polietileno con etiqueta fluorescente a 15 microgramos de hierro por mililitro. La evaluación de los efectos de las concentraciones de siRNA de polietilenimina SPION en la internalización celular mediante el aplastamiento de la tinción azul revela una tinción mínimamente detectable a 7,5 microgramos de hierro por mililitro.Pero manchas claramente visibles a 15 microgramos de hierro por mililitro que no aumentan a mayores concentraciones de hierro probablemente debido a la saturación de absorción de siRNA de polietilenimina SPION. Los macrófagos peritoneales trans infectados con el SIRNA específico de polietilenimina SPION presentan una disminución significativa en los niveles de ARNm de targe en comparación con el siRNA no específico. Sugiriendo que el siRNA puede escapar de las vesículas endocíticas en el citoplasma para llegar a la maquinaria de interferencia de ARN.Después de la inyección intravenosa de una dosis única de complejos de nanopartículas DE polietileno SPION siRNA, el análisis flocentimétrico de células CD11b positivas y CD3 positivas revela una absorción más eficiente de las nanopartículas por CD11b expresando macrófagos que por células positivas CD3 en cualquier momento en todos los órganos examinados. Al intentar este procedimiento es importante recordar preparar la polietilenimina SPION con un potencial de datos promedio no superior a 37 milivoltios y preparar los complejos de siRNA DE SIRNA de polietilenimina SPION en las proporciones bajas de hierro a siRNA. Esta técnica compara la necesidad de que los investigadores exploren el potencial terapéutico de apuntar a los macrófagos en motores animales de enfermedades humanas como el cáncer.

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