Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Detta arbete stöds av den National Natural Science Foundation i Kina (81772308) och nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (nr. 2017YFA0205502).

Alla metoder som involverar levande djur utfördes i enlighet med djuret hand och använda riktlinjerna i sydost University, Kina.
1. beredning av PEI-SPIONs
<ol><li>
Beredning av oljesyra modifierade SPIONs
	<ol>
<li>Lös upp FeCl3•6H2O och FeSO4•7H2O i vatten under skydd av N2.<ol>
<li>Lägg till 28 g FeCl3•6H2O och 20 g FeSO4•7H2O i 80 mL avjoniserat vatten i en bäg...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

Makrofager är refraktära mot transfect av vanliga nonviral tillvägagångssätt, såsom elektroporation, katjoniska liposomer och lipid arter. Här beskrivs vi en pålitlig och effektiv metod för att transfect makrofager med siRNA. Använder detta protokoll, kan över 90% av makrofag-liknande RAW 264,7 celler (figur 2B) och rat peritoneal makrofager18 vara transfekterade med siRNA utan betydande försämring av cellviabiliteten. Denna metod beror på plattformen PE...

Makrofager är en typ av medfödda immunceller som distribueras i alla kroppens vävnader, om än i olika mängder. Genom att producera en mängd cytokiner och andra mediatorer, spelar de avgörande roller i värd försvar mot invaderande mikrobiella patogener, i vävnad reparera efter skada och att upprätthålla vävnad homeostas1. På grund av sin betydelse, har makrofager kontinuerligt varit föremål för intensiv forskning. Men trots dess förekomst i genreglering och funktion studier, siRNA-medierad nedtystning är mindre sannolikt att lyckas i makrofager eftersom dessa celler — särskilt primära makrofager — är ofta svåra att transfect. Detta kan tillskrivas en relativt hög grad av toxicitet associerad med mest väletablerade transfection metoder där cellmembranet är kemiskt (t.ex., med polymerer och lipider) eller fysiskt (t.ex., av elektroporation och gen kanoner) stört för att låta siRNA molekyler korsa membranet, därmed drastiskt minska makrofager bärkraft2,3. Makrofager är dessutom dedikerad fagocyter rik på nedbrytningsvägar enzymer. Dessa enzymer kan skada integritet siRNA, försvaga dess tysta effektivitet även om gene-specifika siRNA har levererats till den cell3,4. En effektiv makrofag-riktade siRNA leveranssystem måste därför skydda integriteten och stabiliteten av siRNA under leverans4.
Det är alltmer uppenbart att dysfunktionella makrofager är inblandade i initiering och progression av vissa gemensamma kliniska sjukdomar som cancer, åderförkalkning och autoimmuna sjukdomar. Av denna anledning, modulerande makrofag funktion med, exempelvis siRNA, har trätt fram som en attraktiv metod för behandling av dessa sjukdomar5,6,7. Även om stora framsteg har gjorts, är en stor utmaning för siRNA-baserad behandlingsstrategi dålig cell specificitet systemiskt administrerade siRNA och otillräcklig siRNA upptaget av makrofager, som följaktligen leder till oönskade bieffekter. Jämfört med gratis nukleinsyra therapeutics som oftast saknar optimal cell selektivitet och ofta leder till biverkningar, drog-loaded nanopartiklar (NPs), på grund av deras spontana benägenhet av fångas upp av det retikuloendoteliala systemet, off-target kan vara konstruerad för passiv inriktning att makrofager i vivo, vilket möjliggör förbättrad terapeutisk effekt med minimal biverkningar8. Nuvarande NPs utforskade för leverans av RNA-molekyler är oorganiska nanocarriers, olika liposomer och polymerer9. Bland dem visar polyethyleneimine (PEI), en typ av katjoniska polymerer kan bindande och kondenserande nukleinsyror i stabiliserad NPs, den högsta RNA levererar kapacitet9,10. PEI skyddar nucleic syror från enzymatisk och nonenzymatic nedbrytning, förmedlar deras överföring över cellmembranet och främjar deras intracellulära release. Även om ursprungligen infördes som en DNA leverans reagens, visades därefter PEI för att vara en attraktiv plattform för i vivo siRNA delivery, antingen lokalt eller systemiskt9,10.
Superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar (SPIONs) har visat mycket lovande i biomedicin, på grund av deras magnetiska egenskaper, biokompatibilitet, jämförbar storlek till biologiskt viktiga objekt, hög yta-området-till-volym förhållande, och lätt att anpassa yta för bioagent bilaga11. Exempelvis på grund av deras potentiella nytta som kontrastmedel och snabbt upptag av makrofager dykt SPIONs upp som en favorit kliniska verktyg till bild vävnad makrofager12. Medan SPIONs har också studerats som nukleinsyra leverans fordon11,13,14,15, att vår kunskap, innehåller litteraturen några rapporter om SPIONs som bärare för makrofag-riktade siRNA delivery. För gen leverans av SPIONs, är deras yta oftast belagda med ett skikt av hydrofil katjoniska polymerer som negativt laddade nukleinsyror kan elektrostatiskt lockade och uppbundna. Här presenterar vi en metod för att syntetisera SPIONs vars yta är modifierad med låg molekylvikt (10 kDa), förgrenade PEI (PEI-SPIONs). Dessa magnetiska nanoplatforms anställs sedan kondensera siRNA, bildar PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex som aktiverar siRNA transport in i cellen. Vi anledning att spontan fagocytos av SPIONs av celler i det retikuloendoteliala system16, tillsammans med stark förmåga av bindande och kondenserande nukleinsyror av PEI, återger PEI-SPIONs lämplig för effektiv transport av siRNA in makrofager. De data som presenteras här stöder genomförbarheten av PEI-DEMOLERADES/siRNA-medierad nedtystning i makrofager i kultur samt i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

På grund av sin kritiska roll i reglering av immunsvar, makrofager har kontinuerligt varit föremål för intensiv forskning och innebära en lovande terapeutiskt mål i många sjukdomar, såsom cancer, åderförkalkning och autoimmuna sjukdomar. RNAi-medierad nedtystning är en värdefull metod val sond och manipulera makrofag funktion; dock transfection av makrofager med siRNA anses ofta vara tekniskt utmanande, och för närvarande finns några metoder tillägnad siRNA överföring till makrofager. Här presenterar vi ett protokoll med polyethyleneimine-belagda superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar (PEI-SPIONs) som ett fordon för riktade leverans av siRNA till makrofager. PEI-SPIONs klarar av bindande och helt kondenserande siRNA när den Fe: siRNA viktförhållandet når 4 och ovan. In vitro, dessa nanopartiklar effektivt kan leverera siRNA primära makrofager, men även in i makrofag-liknande RAW 264,7 cell linje, utan att kompromissa med cellviabilitet på den optimala dosen för transfection, och, slutligen, de inducerar siRNA-medierad mål nedtystning. Frånsett används för in vitro- siRNA transfection, är PEI-SPIONs också en lovande verktyg för att leverera siRNA till makrofager i vivo. Med tanke på dess kombinerade funktioner av magnetiska egendom och nedtystning förmåga förväntas systemiskt administrerade PEI-DEMOLERADES/siRNA partiklar inte bara att modulera makrofag funktion, utan också att aktivera makrofager som ska avbildas och spåras. I huvudsak PEI-SPIONs representerar en enkel, säker och effektiv nonviral plattform för siRNA leverans till makrofager både in vitro- och in vivo.

Storlek och zeta potential PEI-SPIONs tillagade detta protokoll var i intervallet 29-48 nm (polydispertion index: 0.12 - 0,23) och 30-48 mV, respektive. De var stabilt i vatten vid 4 ° C över 12 månader utan uppenbara aggregering. För att utvärdera deras siRNA bindande förmåga, blandades PEI-SPIONs med siRNA på olika Fe: siRNA vikt nyckeltal. Figur 1 visar att när den Fe: siRNA viktförhållandet når 4 och ovan, bandet av gratis siRNA var helt sakna...

Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Vi beskriver en metod för att använda polyethyleneimine (PEI)-belagda superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar för transfecting makrofager med siRNA. Dessa nanopartiklar kan effektivt leverera siRNA att makrofager in vitro- och in-vivo och tystnad mål genuttryck.

Polyethyleneimine-belagda järnoxid nanopartiklar som ett fordon för leverans av små störande RNA till makrofager In Vitro och In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Denna åtgärd kan hjälpa till att besvara viktiga frågor. Inom humanologi. Detta svar i funktionen av makrofager under fysiologiska slutet på patologiska förhållanden.Den största fördelen med denna teknik är att polyetenimine belagda effektivt kan en vitro utan att kompromissa cell. Under optimala doser. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot terapi och diagnos av många kroniska inflammatoriska sjukdomar och cancer.Där makrofager spelar en väsentlig roll för patogenesen. Demonstrera förfarandet kommer att Na Jia. En doktorand från mitt labb.Och Kaixuan Wang en doktorand från Dr.Xiaohua labb. Att förbereda allylic acid modified super paramagnetic järnoxid nanopartiklar eller SPION: s första lägga 28 gram pharas klorid hexahydrat. Och 20 gram pharas selfate heptahydrate till en bägare som innehåller 80 milliliter av avjoniserat vatten.Och använd en glasledning för att föra in kväve i lösningen. Omrörning tills den fasta substansen har upplösts. Värm reaktionsblandningen till 72 grader Celsius med omrörning vid 800 rotationer per minut.Och tillsätt 40 milliliter 28% ammoniakvatten till bägaren. Efter fem minuter lägga nio milliliter av allylic syra droppe klokt. Och behålla blandningen vid 72 grader Celsius i tre timmar med kontinuerlig omrörning.Vid slutet av inkubationen kyla den resulterande lösningen till rumstemperatur. Och fällning blandningen via magnetisk separation enligt standardprotokoll. Tvätta sedan SPIONen som innehåller fällning tre gånger med absolut etylalkohol.Och asperse utfällningen i 100 milliliter n-hexan. För att förbereda dimercapto akrylsyra modifierade SPION's lägga 800 milligram av den allylic syra modifierade SPION's. Dispergeras i 200 milliliter n-hexan och 400 milligram dimercapto akrylsyra sprids i 200 milliliter aceton i en tre hals kolv i ett vattenbad vid 60 grader Celsius.Nästa tillsätt 200 mikroliter av trietylamin droppe klokt att kolven med omrörning vid 1000 rotationer per minut och återlopp. En svart fällning kan erhållas genom magnetisk separation efter fem timmar. Använd sedan tetrametylammoniumhydroxid för att justera lösningens pH för homogen dispersals av de hydrofila SPION:erna i avjoniserat vatten.Degenererade polyeteniminbelagda SPION's lägger till dimercapto akrylsyra modifierade SPION:s kolloidal lösning droppvis i en 10 kilodalton polyeteninlösning. I en 500 milliliter tre hals kolv under mekanisk omrörning vid 1000 rotationer per minut i två timmar. I slutet av inkubationen tillsätt den resulterande lösningen till ett ultrafiltreringsrör med en molekylvikt avskuren på 100 kilodalton och en halt av 15 milliliter.Centrafuse provet tills den återstående lösningen når en en millilitervolym. Tillsätt avjoniserat vatten till lösningen för att få tillbaka volymen till 15 milliliter. Och centrafuse och rehydrera lösningen tio gånger till som bara visat.Filtrera sedan lösningen genom ett 22 mikronfilter för lagring vid fyra grader Celsius. För att förbereda siRNA nanopartiklar först lägga till tre mikroliter av nyberedda 20 mikromolära siRNA-lösningar till fem märkta RNA: s fria mikrocentroafused rör. Och lägg 0, 8, 1,6, 3,2, och 6,4 mikrogram polyeteninin SPION's till rör märkta noll, ett, två, fyra och åtta respektive.Efter blandning med skonsam pipettering, inkubera proverna i 30 minuter vid rumstemperatur för att låta de polyetylenimin SPION siRNA-komplexen bildas. Och förbereda en tre procent agaros gel med jag renhet agarose. I slutet av inkubationen tillsätt en mikroliter av 6X DNA-lastningsbuffert per fem mikroliter prov till varje rör och blanda försiktigt.Sedan ladda alla prover på gelen. Och kör elektrofores på fem volt per centimeter. Tills bromofenolblå färgämnet migrerar två tredjedelar av längden på gelen.En dag före transfektionen tvätta en mus mikrofag som RAW264.7 cell kultur med PBS. Och behandla cellerna med en milliliter på 25%trypsin i fem till tio minuter vid 37 grader Celsius i en fem procent koldioxidinkubator. När majoriteten av cellerna har lossnat.Inaktivera trypsin med fem milliliter av kompletta DMEN. Sedan pippete lösningen flera gånger för att skingra eventuella cellkluster. Överför cellupphängningen till ett sterilt konackelrör på 15 milliliter för centrifugeringen.Sedan åter avbryta cellerna i fem milliliter av färska komplett DMEN för räkning. Späd cellerna till en 4,5 gånger tio till de fjärde cellerna per milliliter av fullständig DMEN koncentration. Och tillsätt två milliliter medium till varje brunn av en sex brunnsplatta för en 24 timmars inkubation i cellodlingsinkubatorn.Nästa dag förbereda lämpligt förhållande av polyetenimine SPION siRNA nanopartiklar i en 1,5 milliliter RNA ström mikrocentrifugrör med mild blandning som just visat. Och tillsätt lämplig volym av polyetenimine SPION siRNA nanopartikel komplex till varje brunn som har ersatts med en milliliter färskt medium. Förbered polyetenimin SPION si komplex.i detta fall många fler månader av polyetenimin SPION kan användas Således minimera deras potentiella toxicitet. Snurra sedan plattan försiktigt för att uppnå en jämn fördelning av nanopartiklarna över brunnsbottnarna. Returnera plattan till cellodling inkubatorn tills efterföljande cellulära uppdatering eller gen knockdown brist analys.Polyetylenimin SPION's med en zeta potential på 30,5 och 37 millivolt uppvisar inte en skenbar cytotoxicitet vid koncentrationer upp till 30 mikrogram järn per milliliter. Vilket är ungefär två gånger hyra än den koncentration som normalt används för cell transfection. Polyetenimin SPION's zeta potential på 48 millivolt är dock giftiga.Även vid den lägsta undersökta dosen. Som analyseras av flödescytometri, kan mer än 90%av celler transfekteras med fluorescerande märkt polyetylenimin siRNA-komplex vid 15 mikrogram järn per milliliter. Bedömning av effekterna av polyetenimine SPION siRNA koncentrationer på cellulära internalisering genom att krossa blå färgning avslöjar minimalt detekterbara färgning på 7,5 mikrogram järn per milliliter.Men tydligt synliga fläckar på 15 mikrogram järn per milliliter som inte ökar vid högre koncentrationer av järn sannolikt på grund av polyeteninIN SPION siRNA upptag mättnad. Peritoneal makrofager transfected med polyetenimine SPION's hysa specifika siRNA uppvisar en betydande minskning av targe mRNA nivåer jämfört med ospecifika siRNA. Tyder på att siRNA kan fly från endocytiska vesiklar in i cytoplasman för att nå RNA-interferens maskiner.Vidare efter intravenös injektion av en enda dos av polyetenimine SPION siRNA nanopartikel komplex flocentimetrical analys av CD11b positiva och CD3 positiva celler avslöjar en effektivare upptag av nanopartiklarna genom CD11b uttrycker makrofager än av CD3 positiva celler när som helst punkt i alla de organ som undersökts. Medan du försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att förbereda polyetenimin SPION's med en genomsnittlig datapotential inte högre än 37 millivolt och att förbereda polyetenimine SPION siRNA komplex på låg järn till siRNA nyckeltal. Denna teknik jämför behovet av forskare att utforska terapeutiska potentialen att rikta makrofag i animaliska motorer av mänskliga sjukdomar som och cancer.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

En strategi för att identifiera de novo mutationer i vanliga sjukdomar som autism och schizofreni

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxisk Stimulering av Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Långsam frisättning Drug Delivery genom Elvax 40W till Rat Retina: Konsekvenser för behandling av kroniska sjukdomar

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Isolera och använda Delar av bovint Mesenteric artär och ven som Bioassay till testet för vasoaktivitet i tunntarmen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetry att mäta Mouse kontraktila Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro och In Vivo upptäckt av Mitophagy i mänskliga celler, C. Elegansoch möss

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Utvärdering av fraktur förhårdnader utveckling under läkning hos möss med en MRI-kompatibel osteosyntes enhet för mus lårbenet

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...