Name: polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81772308) ve ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (No. 2017YFA0205502) tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntemleri içeren canlı hayvan hayvan uygun olarak gerçekleştirilen bakım ve Güneydoğu Üniversitesi, Çin'in yönergeleri kullanın.
1. hazırlanması PEI-SPIONs
<ol><li>
Oleik asit-modified SPIONs hazırlanması
	<ol>
<li>FeCl3•6H2O ve FeSO4•7H2O N2koruması altında suda çözülür.<ol>
<li>FeCl3•6H2O 28 g ve 20 g FeSO4•7H2O 80 mL deiyonize su içine bi...

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expression+of+Exogenous+Genes+in+Macrophages:+Obstacles+and+Opportunities.">The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities.</a> Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).</li><li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo.">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).</li><li>Davignon, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+monocytes/macrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li><li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy.">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis.">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).</li><li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases.">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li><li>H&#246;bel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo.">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery.">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).</li><li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles:+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection.">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li><li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors:+Characterization+and+stability+evaluation.">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li><li>Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles.">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li><li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles:+theory+to+practice.">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li><li>Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+(II)+and+total+iron+with+1,+10-phenanthroline.">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis.">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li><li>Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles.">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection.">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).</li><li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs.">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li><li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology.">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).</li><li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells.">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li><li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+nanoparticles+and+the+immune+system.">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li><li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., P&#233;rez-Yag&#252;e, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics.">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li></ol>

Makrofajlar çoğalmasıyla, katyonik lipozomlar ve lipid türler gibi yaygın olarak kullanılan nonviral yaklaşımlarla transfect ateşe dayanıklı. Burada makrofajlar siRNA ile transfect için güvenilir ve etkin bir yöntem açıklanmıştır. Mevcut iletişim kuralını kullanarak, fazla makrofaj gibi ham 264.7 hücreleri (Şekil 2B) ve fare peritoneal makrofajlar%18 90 siRNA önemli hücre canlılığı bozulma olmadan ile transfected. Bu yöntem bir nanocarri...

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri tüm vücut dokuları içinde dağıtılmış bir türü farklı miktarlarda da olsa vardır. Çeşitli sitokinlerin ve diğer arabulucu üreterek, onlar mikrobiyal patojenler istila karşı ana savunma, yaralanma takip doku onarımı ve doku homeostazı1korumada önemli rol oynarlar. Önemleri nedeniyle makrofajlar sürekli yoğun araştırma konu oldu. Ancak, gen düzenlemesi ve işlev çalışmalar yaygınlık rağmen gen siRNA aracılı susturmak için makrofajlar başarılı olasılığı daha düşüktür bu hücreler — özellikle, birincil makrofajlar — çoğu kez transfect zor. Bu hücre zarı olan kimyasal olarak en köklü transfection yaklaşımlar ile ilişkili toksisite (Örneğin, polimerler ve lipidler) nispeten yüksek derecede atfedilen veya fiziksel olarak (Örneğin, Elektroporasyon tarafından ve Böylece büyük ölçüde azaltarak makrofajlar canlılığı2,3membran çapraz siRNA molekülleri izin gen silah) bozulur. Ayrıca, makrofajlar adanmış fagositler degradative enzimler zengin vardır. Bu enzimler siRNA, gene özgü siRNA hücre3,4teslim olsa bile silencing verimlilik zayıflaması bütünlüğünü zarar verebilir. Bu nedenle, bir etkili makrofaj hedefli siRNA teslim sistem bütünlüğü ve istikrarı siRNA teslim4sırasında korumak gerekiyor.
Disfonksiyonel makrofajlar başlatma ve otoimmün hastalıkları, ateroskleroz ve kanser gibi bazı ortak klinik bozukluklar ilerlemesini karıştığı giderek belirgin olduğu. Bu nedenle makrofaj işlevini kullanarak, örneğin, siRNA, oransal, bu bozuklukları5,6,7tedavisi için çekici bir metodoloji olarak ortaya çıkan olmuştur. Ne kadar çok ilerleme yaptı, sistemik yönetilen siRNA ve sonuç olarak istenmeyen yan etkilere neden makrofajlar tarafından yetersiz siRNA alımını zavallı hücre özgüllük siRNA dayalı tedavi stratejisinin büyük bir sorun olduğunu. Genellikle optimum hücre seçicilik eksikliği ve sık sık hedef kapalı yan etkiler, ilaç dolu nano tanecikleri (NPs), retiküloendotelyal sistem tarafından yakalanan spontan onların eğilimi nedeniyle yol ücretsiz nükleik asit tedavi ile karşılaştırıldığında, makrofajlar vivo içindebırakmak için en az yan etkileri8ile geliştirilmiş tedavi edici etkinliği, pasif hedefleme için tasarlanmış. Geçerli NPs RNA molekülleri teslimi için araştırdı inorganik nanocarriers, çeşitli lipozomlar ve polimerler9içerir. Bunlar arasında kapasitesi9,10teslim etmek yüksek RNA polyethyleneimine (PEI), Katyonik Polimerler bağlama ve nükleik asitler stabilize NPs yoğuşmalı yeteneğine sahip bir türünü gösterir. PEI nükleik asitler enzimatik ve nonenzymatic bozulma korur, transfer hücre zarı arasında aracılık eder ve onların hücre içi serbest teşvik etmektedir. Her ne kadar başlangıçta bir DNA teslim reaktifi tanıttı, PEI daha sonra vivo içinde siRNA teslimi, ya yerel olarak veya sistemik9,10çekici bir platform olacak şekilde gösterilmiştir.
Superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri (SPIONs) içinde biyomedikal, kendi manyetik özellikleri, biyouyumluluk, biyolojik olarak önemli nesnelerine, yüksek hacim için yüzey alanı oranı, karşılaştırılabilir boyutu nedeniyle büyük söz göstermiştir ve kolayca uyarlanabilir yüzey düşündüğümüzden Eki11. Örneğin, bir kontrast Ajan ve makrofajlar tarafından hızlı alımı olarak onların potansiyel yarar nedeniyle, SPIONs bir favori klinik araç görüntü doku makrofajlar12olarak ortaya çıkmıştır. SPIONs da yaygın nükleik asit teslimat Araçlar11,13,14,-15, bizim bilgi olarak incelenmiştir iken edebiyat bir taşıyıcı olarak SPIONs birkaç raporları içerir makrofaj hedefli siRNA teslim. SPIONs tarafından gen teslim için onların yüzey genellikle üzerine olumsuz ücret nükleik asitler elektrostatik çekti kaşif balonlu keşif ve hidrofilik Katyonik Polimerler bir tabaka ile kaplanır. Burada, SPIONs olan yüzey düşük moleküler ağırlıklı ile (10 kDa), dallı PEI (PEI-SPIONs) değiştirilir sentezleme yöntemi mevcut. Bu manyetik nanoplatforms sonra siRNA, hücre içine siRNA taşıma etkinleştirmek PEI-casus/siRNA kompleksleri şekillendirme yoğunlaşmak için istihdam edilmektedir. Retiküloendotelyal sistem16hücreleri tarafından SPIONs o kendiliğinden fagositoz nedeni, bağlama güçlü yeteneği ile birleştiğinde ve nükleik asitler tarafından PEI, yoğuşmalı PEI-SPIONs siRNA etkin taşıma için uygun işler makrofajlar. Burada sunulan veri PEI-casus/siRNA-aracılı gen kültür hem de vivo içindemakrofajlar içinde yalıtım fizibilite destekler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31608-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (1.5 ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium-based MTS assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td>For cytotoxicity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 cell line</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td>
			<td>TCM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (6-well)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes (10 cm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free tubes (1.5 ml)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wistar rats</td>
			<td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese 
			Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus Calmette&#8211;Gu&#233;rin freeze-dried powder</td>
			<td>National 
			Institutes for Food and Drug Control, China</td>
			<td></td>
			<td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA</td>
			<td>GenePharma (Shanghai, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-siRNA</td>
			<td>RiboBio (Guangzhou, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (10 kDa)</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>E107079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia water</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>A112077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>O108484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D103272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10012118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#8226;6H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimercaptosuccinic acid</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>D107254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td>
			<td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>T100882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle size and zeta potential analyzer</td>
			<td>Malvern, England</td>
			<td>Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles as a vehicle for the delivery of small interfering rna to macrophages in vitro and in vivo

Bağışıklık yanıtı düzenlenmesinde önemli rolleri nedeniyle makrofajlar sürekli yoğun araştırma konu oldu ve otoimmün hastalıkları, ateroskleroz ve kanser gibi birçok hastalıklarda umut verici bir terapötik hedef temsil eder. RNAi aracılı gen susturmak yoklama ve makrofaj işlevi değiştirmek için seçim değerli bir yaklaşımdır; Ancak, makrofajlar siRNA ile transfection kez teknik olarak zor olabilir kabul edilir ve, makrofajlar siRNA aktarmak için adanmış birkaç metodolojileri mevcuttur. Burada, polyethyleneimine kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri (PEI-SPIONs) siRNA makrofajlar için hedeflenen teslim için bir araç olarak kullanarak bir iletişim kuralı mevcut. PEI-SPIONs bağlama ve Fe: siRNA ağırlık oranı 4 ulaştığında tamamen siRNA Yoğuşmalı ve üzeri yeteneğine sahiptirler. Vitro, bu nano tanecikleri verimli siRNA birincil makrofajlar içine yanı sıra olmadan ödün hücre canlılık transfection için en uygun doz, makrofaj gibi ham 264.7 hücre kültürünü içine teslim edebilir ve sonuçta, onlar neden siRNA aracılı hedef gen susturmak. Vitro siRNA transfection için kullanılan dışında PEI-SPIONs da siRNA makrofajlar içinde vivoiçin teslim etmek için umut verici bir araç vardır. İçinde görüş-in kombine özellikleri manyetik özelliği ve gen susturmak yeteneği, sistemik yönetilen PEI-casus/siRNA parçacıklar sadece makrofaj işlevi modüle için aynı zamanda yansıma ve izlenen makrofajlar etkinleştirmek için bekleniyor. Özünde, bir basit, güvenli ve etkili nonviral platform siRNA teslim edilmek üzere makrofajlar PEI-SPIONs temsil vitro ve içinde vivo.

Boyutu ve zeta potansiyel PEI-SPIONs bu iletişim kuralı ile hazırlanan edildi 29-48 nm aralığında (polydispersity Dizin: 0,12 - 0,23) ve 30-48 mV, anılan sıraya göre. Onlar için 12 ay boyunca açık toplama olmadan su 4 ° C'de kararlı idi. Yetenek bağlama onların siRNA değerlendirmek için PEI-SPIONs siRNA, çeşitli Fe: siRNA ağırlık oranları ile karıştırıldı. Şekil 1 gösterir Fe: siRNA ağırlık oranı 4 ulaştığında ve yukarı...

Watch this Scientific Journal Video about Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Biz polyethyleneimine (PEI) kullanarak bir yöntemi açıklamak-kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri siRNA ile transfecting makrofajlar için. Bu nano tanecikleri siRNA makrofajlar vitro ve in vivo ve sessizlik hedef gen ekspresyonu için verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz.

Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Bu önlem anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İnsanbilim alanında. Patolojik koşullara fizyolojik son makrofajların işlevinde bu cevap.Bu tekniğin en büyük avantajı polietilennemi kaplı verimli hücre ödün vermeden en vitro olabilir. En uygun dozlarda. Bu tekniğin etkileri tedavi ve birçok kronik inflamatuar bozukluklar ve kanserlerin tanısı doğru uzanır.Makrofajların patogenezde önemli rol oynadığı yer. Prosedürü gösteren Na Jia olacak. Laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi.Ve Kaixuan Wang, Dr. Xiaohua'nın laboratuvarından yüksek lisans öğrencisi. Allylic asit modifiye süper paramanyetik demir oksit nano tanecikleri veya SPION ilk pharas klorür heksahidat 28 gram ekleyin hazırlamak için. Ve 20 gram pharas selfate heptahydrate içeren bir kabın 80 mililitre deiyonize su.Ve çözeltiye azot sokmak için cam bir kanal kullanın. Katı madde eriyene kadar karıştırılır. Reaksiyon karışımını dakikada 800 dönüşle karıştırarak 72 santigrat dereceye ısıtın.Ve kabına 40 mililitre %28 amonyya suyu ekleyin. Beş dakika sonra allylic asit damla bilge dokuz mililitre ekleyin. Ve karışımı 72 derecede sürekli karıştırarak üç saat boyunca saklayın.Kuluçka sonunda oda sıcaklığına çıkan çözeltisoğun. Ve standart protokollere göre manyetik ayırma yoluyla karışımı çökeltin. Daha sonra çökelti içeren SPION'u üç kez mutlak etil alkolle yıkayın.Ve çökeltiyi 100 mililitre n-heksane ile asperse. Dimercapto akrilik asit modifiye SPION's hazırlamak için allylic asit modifiye SPION's 800 miligram ekleyin. 200 mililitre n-heksane ve 400 miligram dimercapto akrilik asit içinde dağılmış 200 mililitre aseton içinde 60 santigrat derecede bir su banyosunda üç boyun şişesine dağılmış.Sonraki dakikada 1000 rotasyonları ve reflü ile karıştırma ile şişe akıllıca triethylammine damla 200 mikrolitre ekleyin. Siyah bir çökelti beş saat sonra manyetik ayırma ile elde edilebilir. Daha sonra tetramethylammonium hidroksit kullanarak çözeltinin pH'ını hidrofilik SPION'un deiyonize sudaki homojen dağılımları için ayarlayın.Dejenere polietilen kaplı SPION's dimercapto akrilik asit modifiye SPION kolloidal çözeltisi 10 kilodalton polietilen çözeltisi içine akıllıca damla ekleyin. 500 mililitrelik üç boyun şişesinde iki saat boyunca dakikada 1000 dönüşle mekanik karıştırma altında. Kuluçka sonunda 100 kilodalton ve 15 mililitre lik bir içerik kesilmiş bir moleküler ağırlık ile ultra filtrasyon tüpü için ortaya çıkan çözüm ekleyin.Kalan çözelti bir mililitre hacmine ulaşana kadar numuneyi centrafuse kullanın. Hacmi 15 mililitreye geri getirmek için çözeltiye deiyonize su ekleyin. Ve centrafuse ve sadece gösterildiği gibi on kat daha fazla çözelti rehydrate.Daha sonra çözeltiyi 4 santigrat derecede depolamak için 22 mikron filtreden geçirin. SiRNA nano tanecikleri hazırlamak için ilk taze hazırlanmış 20 mikromolar siRNA çözeltisi üç mikrolitre eklemek beş etiketli RNA ücretsiz mikrosanroafused tüpler. Ve 0, 8, 1.6, 3.2 ve 6.4 mikrogram polietilenin SPION's tüpler ilerler sıfır, bir, iki, dört ve sekiz sırasıyla etiketli.Nazik pipetleme ile karıştırıldıktan sonra, polietilen inilmin SPION siRNA komplekslerinin oluşmasını sağlamak için numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Ve ben saf agarose ile yüzde üç agarose jel hazırlayın. Kuluçka sonunda her tüp için örnek beş mikrolitre başına 6X DNA yükleme tampon bir mikrolitre ekleyin ve dikkatle karıştırın.Daha sonra tüm örnekleri jel üzerine yükleyin. Ve elektroforezi santimetrede beş volta çalıştırın. Bromofenol mavisi boya jel üzerinde uzunluğunun üçte ikisini göç edene kadar.Transfeksiyondan bir gün önce RAW264.7 hücre kültürü gibi bir fare mikrofajını PBS ile yıkayın. Ve hücreleri %25 tripsin mililitresi ile tedavi edin. Hücrelerin çoğu koptuğunda.Tam DMEN beş mililitre ile tripsin inaktive. Sonra herhangi bir hücre kümeleri dağıtmak için çözelti birkaç kez pippete. Santrifüj için hücre süspansiyonunu steril 15 mililitrelik conackel tüpe aktarın.Sonra tekrar sayma için taze tam DMEN beş mililitre hücreleri askıya. Hücreleri tam DMEN konsantrasyonunun mililitresi başına 4,5 kat on ile dördüncü hücrelere seyreltin. Ve hücre kültürü kuluçka 24 saat kuluçka için altı kuyu plaka her kuyuya orta iki mililitre ekleyin.Ertesi gün polietilennemimine SPION siRNA nano tanecikleri uygun oranı hazırlamak 1.5 mililitre RNA akarsu mikrosantrifüj tüp nazik karıştırma ile sadece gösterildiği gibi. Ve her kuyuya uygun polietilen neneimin SPION siRNA nanopartikül kompleksinin hacmini ekleyin ve bir mililitre taze ortam la değiştirilmiştir. Polietilen nenemin SPION si kompleksleri hazırlayın.Bu durumda polietilen infesonin SPION çok daha fazla ay böylece potansiyel toksisite en aza indirmek için kullanılabilir. Sonra iyi dipleri arasında nano tanecikleri eşit bir dağılım elde etmek için dikkatle plaka girdap. Sonraki hücresel güncelleme veya gen nakavt eksikliği analizi kadar hücre kültürü kuluçka için plaka dönün.30.5 ve 37 milivolt zeta potansiyeline sahip polietileninspiin SPION's mililitre başına demir 30 mikrogram kadar konsantrasyonlarda belirgin bir sito toksisitesi göstermez. Normalde hücre nakli için kullanılan konsantrasyondan yaklaşık iki kat daha fazla. Polietilennemimine SPION'un zeta potansiyeli 48 milivolt ancak toksiktir.En düşük dozda bile incelendi. Akış sitometrisi tarafından analiz edildiği gibi, hücrelerin %90'ından fazlası floresan olarak etiketlenmiş polietilen spion siRNA kompleksleri ile mililitrede 15 mikrogram demirle geçirilebilir. Polietilenin SPION siRNA konsantrasyonlarının mavi boyamayı ezerek hücresel içleştirme üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi, mililitrede 7,5 mikrogram demirde minimal tespit edilebilir boyama olduğunu ortaya koymaktadır.Ama açıkça görülebilen noktalar 15 mikrogram demir mililitre başına büyük olasılıkla polietilen nemine infekas siRNA alımı doygunluğu nedeniyle demir yüksek konsantrasyonlarda artmaz. Polietilen ingelamin SPION'un spesifik siRNA'sı ile transperferant makrofajlar, spesifik olmayan siRNA'ya göre targe mRNA düzeylerinde önemli bir azalma sergilemektedir. SiRNA'nın endositik veziküllerden sitoplazmaya kaçarak RNA girişim mekanizmasına ulaşabileceğini düşündürüyor.Cd11b pozitif ve CD3 pozitif hücrelerin intravenöz enjeksiyonundan sonra CD11b pozitif ve CD3 pozitif hücrelerin flocentimetrical analizi, incelenen tüm organların herhangi bir noktasında CD3 pozitif hücrelere göre makrofajları ifade eden NANO partiküllerin CD11b ile daha verimli bir şekilde alımını ortaya koymaktadır. Bu prosedürü denerken, polietileninspiin SPION'un ortalama veri potansiyelini 37 milivolttan fazla olmayan bir şekilde hazırlamayı ve düşük demir deki polietilen ingezamin SPION siRNA komplekslerini siRNA oranlarına hazırlamayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların insan ve kanser gibi insan hastalıklarının hayvan motorlarında makrofajı hedeflemenin terapötik potansiyelini keşfetme ihtiyacını karşılaştırır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Ortak Bozuklukları de Novo Mutasyonlar, otizm ve şizofreni gibi tanımlayın Bir Strateji

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Rat Retina için Elvax 40W ile yavaş salınımlı İlaç Dağıtım: Kronik Koşullar Tedavisinde Etkileri

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Bir Biyoassay olarak Sığır Mezenterik Arter ve Ven Bölüm yalıtma ve kullanma İnce Barsak vazoaktiviteye için Test

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Rahim içi Telemetri Fare Kontraktil Basıncını Ölçmek<em&gt; İn Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Vivo Fare uyluk için bir MRI uyumlu Osteosentez aygıtı kullanma farelerde kemik iyileşme sırasında kırık Kallus gelişimi değerlendirme

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...