Name: nerve stem cell differentiation by a one-step cold atmospheric plasma treatment in vitro
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Huazhong Scholar Program, le fonds d’Innovation indépendante de l’Université Huazhong des sciences et de technologie (n° 2018KFYYXJJ071) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (nos 31501099 et 51707012).

1. cell Cultures et Predifferentiation
<ol><li>
Predifferentiation et la culture de cellules souches neurales
	<ol>
<li>Préparer les lamelles de poly-D-lysine-enduit. Mettre une lamelle stérile (20 mm de diamètre) dans une plaque de 12 puits. Recouvrir le couvercle en verre avec poly-D-lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau (Table des matières) pour une meilleure adhérence de la cellule sur le couvre-objet en suivant les étapes suivantes. Remarque : Des conditions optimales doivent ...

<ol>
	<li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+neural+stem+cells.">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li><li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases:+dreams+and+reality.">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li><li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology.">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).</li><li>Weltmann, K. D., von Woedtke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+medicine-current+state+of+research+and+medical+application.">Plasma medicine-current state of research and medical application.</a> Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).</li><li>Lloyd, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+Plasma:+Medical+Uses+and+Developments+in+Wound+Care.">Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care.</a> Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).</li><li>Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+plasmas+at+atmospheric+pressure:+toward+new+pharmaceutical+treatments+in+medicine.">Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine.</a> Fundamental &amp; Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).</li><li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Treatment+of+Onychomycosis.">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li><li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation.">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li><li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats.">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li><li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer.">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain.">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fixatives+for+Immunostaining.">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Cell+Membranes.">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li></ol>

C17.2-CNS est une sorte de ligne immortalisé les cellules souches neurales de cellules de souris néonatales couche granuleuse cérébelleuse, développé par Snyder et d’autres10,11. C17.2-CNS peuvent se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes et sont largement utilisés dans les neurosciences12. Dans notre étude précédente, casquettes pourraient favoriser la différenciation des C17.2-CNS en neurones. Une étude d...

La différenciation dirigée des CNS en une certaine lignée pour le transport de tissus est considérée comme une des thérapies plus prometteuses de maladies neurodégénératives et Alhzeimer1. Par exemple, les neurones dopaminergiques catécholaminergiques sont particulièrement souhaitées dans le traitement de la maladie de Parkinson (MP). Cependant, les méthodes traditionnelles pour préparer les cellules souhaitées pour le transport ont beaucoup d’inconvénients, tels que la toxicité chimique, la formation de cicatrices ou autres, qui empêche en grande partie les demandes des CNS en médecine régénérative2. Par conséquent, il est très nécessaire de trouver un roman et un moyen sûr pour la différentiation de la NSC.
Le plasma est le quatrième état de la matière, suivant solides, liquides et gaz, et elle constitue plus de 95 % des affaires dans l’univers tout entier. Plasma est électriquement neutre avec non consolidé positif/négatif et de particules neutres et est généralement générée par une décharge haute tension en laboratoire. Dans les deux dernières décennies, l’application du plasma en biomédecine a attiré l’attention énorme dans le monde entier comme le développement de la technologie du plasma froid la pression atmosphérique. Grâce à cette technique, plasma à basse température stable peut être générée dans l’air ambiant à l’atmosphère sans formation de l’arc et se compose de diverses espèces réactives, comme les espèces réactives de l’azote (RNS), espèces réactives de l’oxygène (ROS), aux ultraviolets (UV) rayonnement, électrons, ions et champ électrique3. Casquettes ont des avantages uniques pour l’inactivation des micro-organismes, le traitement du cancer, la cicatrisation, traitement des maladies de la peau, la prolifération cellulaire et cellules différenciation4,5,6,7. Dans un travail antérieur, nous avons démontré que jet de plasma atmosphérique froid peut améliorer la différenciation des CNS dans les cellules souches neurales murin C17.2 (C17.2-CNS) tant primaires de rats des cellules souches neurales, présentant un grand potentiel pour devenir un outil puissant pour le réalisé différenciation des CNS8. Bien que le mécanisme de mise en valeur de CAP de la différenciation du NSC n’est pas entièrement compris encore, NO généré par CAPs a été prouvé d’être un facteur clé dans le processus. Dans ce travail, nous visons à fournir un plan expérimental détaillé de l’utilisation d’un plasma d’hélium/oxygène pression atmosphérique jet pour le traitement des CNS en vitro, préparation de cellules et prétraitement, observation de la morphologie par microscope inversé, et observation de microscopie par fluorescence d’immunofluorescence souillant.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:123px;">NEST</td>
			<td style="width:344px;">801008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donor Horse serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30074.03</td>
			<td>tored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>25300054</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0098</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum Blocking Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-Nestin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>AF2215</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2200</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-O4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1326</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">anti-NF200</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">anti-ChAT</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">anti- LHX3</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">anti-GABA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">anti-Serotonin</td>
			<td style="width:123px;">Abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">anti-TH</td>
			<td style="width:123px;">Abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0103</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0516</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488- Labeled Goat</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0428</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-well plate</td>
			<td>corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 cm2 flask</td>
			<td>corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33258</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1018</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0128</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Nanjing Jiangnan Novel Optics Company</td>
			<td>XD-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High &#8211; voltage Power Amplifier</td>
			<td>Directed Energy</td>
			<td>PVX-4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DC power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>SL1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Function Generator</td>
			<td>Aligent&#160;</td>
			<td>33521A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oscilloscope</td>
			<td style="width:123px;">Tektronix</td>
			<td style="width:344px;">DPO3034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High voltage probe</td>
			<td style="width:123px;">Tektronix</td>
			<td style="width:344px;">P6015A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nerve stem cell differentiation by a one-step cold atmospheric plasma treatment in vitro

Comme le développement de la technologie plasma physique, plasmas atmosphériques froids (CAPs) ont été largement étudiées dans la décontamination, le traitement du cancer, la cicatrisation des plaies, traitement de canal, etc., formant un nouveau champ de recherche nommé plasma médecine. Est un mélange d’espèces réactives électriques, chimiques et biologiques, casquettes ont montré leurs capacités à améliorer la différenciation des cellules souches nerveuses les deux in vitro et in vivo et sont devenant une voie prometteuse pour le traitement des maladies neurologiques dans l’avenir. Les nouvelles beaucoup plus excitants sont qu’utilisant des amorces à peut réaliser en une seule étape et en toute sécurité réalisé, différenciation des cellules souches neurales (CNS) pour le transport du tissu. Nous montrons ici le protocole expérimental détaillé d’utilisant un dispositif de CAP jet fait par soi-même afin d’améliorer la différenciation NSC C17.2-CNS et primaires de rats des cellules souches neurales, ainsi qu’observant le sort de la cellule par inversé et microscopie de fluorescence. Avec l’aide d’immunofluorescence souillant la technologie, nous avons trouvé les deux les CNS ont montré un taux de prime accéléré que le groupe non traité, et ~ 75 % des CNS sélectivement différencient en neurones, qui sont principalement des adultes, cholinergiques et moteur neurones.

La morphologie cellulaire a été observée au microscope inversé tous les jours après le traitement de la CAP. Figure 2 montre les images de microscopie ordinaire inversé à contraste de phase de la différenciation cellulaire dans les deux lignées cellulaires. Le groupe imprégnées de plasma expose un taux de différentiation accélérée et un taux élevé de différenciation comparée au groupe contrôle et gaz flux.
<p class="j...

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Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Différenciation des cellules souches nerveuses par un traitement d’un Plasma atmosphérique froid en une seule étape d' In Vitro

Ce protocole vise à fournir une procédure expérimentale détaillée d’un traitement plasma atmosphérique froid sur les cellules souches neurales et détection par immunofluorescence pour l’amélioration de la différenciation.

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

Cette méthode a le potentiel d’améliorer la différenciation des cellules souches neurales in vitro et de contribuer au traitement des maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson. Les principaux avantages de cette technique sont que les plasmas atmosphériques froids peuvent être appliqués en une seule étape pour la différenciation dirigée sûre des cellules souches neurales pour la transplantation de tissus. Le plasma atmosphérique froid peut améliorer la différenciation des cellules souches neurales dans un court laps de temps de traitement.Et avec besoin plus de dommages aux cellules, fournissant les cellules désirées pour la transplantation. Commencez par ensemencer environ cinq fois dix à la cinquième cellule souche neurale murine dans un flacon carré de 25 centimètres. Contenant cinq millilitres de DMEM complet pendant deux à trois jours à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone.Lorsque les cellules atteignent 85 pour cent de confluence, laver la culture avec un millilitre de PBS. Avant le traitement, avec un millilitre de trypsine de 25 pour cent pendant une minute. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec un millilitre de milieu de culture.Et pipette plusieurs fois pour générer une suspension à cellule unique. Après comptage, diluer les cellules à deux fois dix à la quatrième cellule par concentration millilitre. Ensemencer un millilitre de cellules souches sur un glissement de couverture recouvert de poly-D-lysine par puits dans neuf puits d’une plaque de culture de 12 cellules.Vérifiez la densité cellulaire au microscope. Et retourner les cellules à l’incubateur pendant 12 heures. Lorsque les cellules se sont attachées, laver le couvercle glisse deux fois avec un millilitre de PBS par lavage, et traiter les cellules avec un milieu de différenciation pendant 48 heures.Pour l’acquisition du jet, connectez d’abord le fil de sortie de l’alimentation électrique à l’appareil à réaction plasma. Et la pointe de la sonde à haute tension avec le fil de sortie pour détecter la tension. Connectez ensuite l’autre extrémité de la sonde à haute tension à l’oscilloscope pour enregistrer les informations de la tension de sortie.Vérifiez l’ensemble du circuit pour vous assurer que l’alimentation électrique, l’oscilloscope et la sonde à haute tension sont tous cloués au sol. Et vérifiez la conduite de gaz pour vous assurer que le tube à gaz est connecté à l’appareil à réaction plasma. Ensuite, ouvrez les valves de gaz d’hélium et d’oxygène et réglez le flux de gaz à un rapport d’un litre à 01 litres par minute d’hélium à l’oxygène.Vérifiez à nouveau le circuit et appuyez sur le bouton de sortie pour créer un jet plasma. Pour traiter plasma les cellules souches neurales, réglez la distance entre la buse de seringue et le premier puits de cellules à 15 millimètres. Remplacez les supernatants dans les cultures de cellules souches neurales par 800 microlitres de milieu de différenciation frais.Et placez la plaque sous les jets de plasma. S’assurer que la buse de seringue est fixée au-dessus du centre de chaque puits. Créer trois puits avec plasma pendant 60 secondes par traitement, et trois puits avec un pour cent d’hélium et de gaz d’oxygène pendant 60 secondes par traitement.Laissant trois puits non traités, comme contrôles. Remplacez ensuite les supernatants par un millilitre de milieu de différenciation frais. Et retourner les cellules à l’incubateur pendant six jours.Vérifiez quotidiennement l’état de différenciation des différents groupes, sous un microscope à contraste de phase inversé. Après le traitement, laissez les cellules s’équilibrer complètement dans le milieu de la condition pendant environ une heure avant de remplacer le supernatant par un milieu de différenciation frais. Pour l’analyse de l’immunofluorescence, fixer les cultures avec 500 microlitres de quatre pour cent de paraformaldéhyde par puits pendant 20 minutes à température ambiante.Suivi de trois rinçages doux de cinq minutes, avec un millilitre de PBS par lavage. Ensuite, perméabilize les échantillons fixes avec 2 pour cent Triton X-100 en PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Suivi d’un rinçage doux comme démontré.Après le dernier lavage, bloquer toute liaison non spécifique avec un millilitre de sérum de chèvre de 10 pour cent dans PBS par échantillon pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, étiqueter les cellules de chaque puits avec 300 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Suivi de trois lavages dans PBS comme démontré.Après le dernier lavage, étiquetez les cellules avec 300 microlitres des anticorps secondaires appropriés. Incuber pendant deux heures à température ambiante, à l’abri de la lumière. Rincez ensuite doucement les cellules avec un millilitre de PBS par puits pendant dix minutes à température ambiante.Imagez les cellules sur un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés. Les cellules souches neurales traitées au plasma présentent un taux de différenciation accéléré et un rapport de différenciation plus élevé par rapport au contrôle non traité, et le flux de gaz a traité les cellules souches. Après le traitement plasmatique, Nestin diminue.Beta-Tubulin III augmente considérablement. Et o4 augmente légèrement, par rapport au contrôle traité et le flux de gaz traités cellules souches. En outre, après 60 secondes de traitement de plasma, une expression robuste du neurone mûr, du neurone cholinergique, et des marqueurs de neurone moteur est observée.Avec très peu de neurones GABAergic et sérotonergiques, et aucun neurone dopaminergique détecté. Tout en essayant ces procédures, il est important de se rappeler, traiter les cellules avec le dosage approprié de plasma, parce qu’une longue et intense période de traitement de plasma incitera l’apoptose cellulaire ou la nécrose. N’oubliez pas également de pré-tester la viabilité de la cellule avant l’application en aval.

Research

JoVE Journal

Engineering

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

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Enquête de l&#39;évolution rapide du plasma induite par lasers engendrent des impulsions

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Recherche

Ingénierie

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How to Ignite an Atmospheric Pressure Microwave Plasma Torch without Any Additional Igniters

Comment Ignite une pression atmosphérique à micro-ondes de la flamme plasma sans aucune Allumeurs supplémentaires

This movie shows how an atmospheric pressure plasma torch can be ignited by microwave power with no additional igniters. After ignition of the plasma, a ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

Culture in vitro de cellules épicardiques De Coeur souris embryonnaires

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Applying X-ray Imaging Crystal Spectroscopy for Use as a High Temperature Plasma Diagnostic

L&#39;application X-ray Imaging Cristal Spectroscopie pour l&#39;utilisation en tant que haute température Diagnostic plasma

X-ray spectra provide a wealth of information on high temperature plasmas; for example electron temperature and density can be inferred from line ...

An Atmospheric Pressure Plasma Setup to Investigate the Reactive Species Formation

Une configuration de plasma Pression atmosphérique pour enquêter sur la formation espèces réactives

Non-thermal atmospheric pressure (&#39;cold&#39;) plasmas have received increased attention in recent years due to their significant biomedical potential. ...

Ice Generation and the Heat and Mass Transfer Phenomena of Introducing Water to a Cold Bath of Brine

Génération de glace et de la chaleur et de masse Transfert Phénomènes d&#39;eau Présentation à un bain froid de la saumure

We demonstrate a method for the study of the heat and mass transfer and of the freezing phenomena in a subcooled brine environment. Our experiment showed ...

Spark Plasma Sintering Apparatus Used for the Formation of Strontium Titanate Bicrystals

Spark Plasma Sintering appareil utilisé pour la formation de titanate de strontium bicristaux

A spark plasma sintering apparatus was used as a novel method for diffusion bonding of two single crystals of strontium titanate to form bicrystals with ...

New Application of an Atmospheric Pressure Plasma Jet as a Neuro-protective Agent Against Glucose Deprivation-induced Injury of SH-SY5Y Cells

Nouvelle Application d’un Jet de Plasma de la pression atmosphérique comme Agent neuroprotecteur contre les dommages causés par les privations de Glucose des cellules SH-SY5Y

The atmospheric pressure plasma jet (APPJ) has attracted the attention of many researchers from multiple disciplines in recent years because its emissions ...

Atmospheric Pressure Fabrication of Large-Sized Single-Layer Rectangular SnSe Flakes

Fabrication de la pression atmosphérique de grande taille simple couche rectangulaire SnSe flocons

Tin selenide (SnSe) belongs to the family of layered metal chalcogenide materials with a buckled structure like phosphorene, and has shown potential for ...