Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

وأيد هذا البحث المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة K01HL133520 (PS) و K12HD055882 (PS). يشكر المؤلفون الدكتور جوانا فلورس للمساعدة مع تجارب التعرض للأوزون.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية بنسلفانيا.
1-تقييم مرحلة دورة الشبقية
<ol><li>كبح جماح أنثى الفأر C57BL/6 (8-9 أسابيع من العمر) باستخدام الماوس بيد واحدة ضبط النفس الأسلوب الموصوفة في ماكهولز et al.10بشكل صح...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MicroRNA التنميط أسلوب مفيد لتشخيص الأمراض والأبحاث الميكانيكية. في هذه المخطوطة، حددنا بروتوكولا لتقييم التعبير عن ميرناس الذي يتوقع أن تنظم جينات التهاب في الرئتين من الإناث الفئران المعرضة للأوزون في مراحل مختلفة من دورة الشبقية. أساليب لتحديد دورة الشبقية، مثل طريقة الكشف البصري، قد وص?...

ميكرورناس (ميرناس) هي قصيرة (19 إلى 25 النيوكليوتيدات)، تحدث بشكل طبيعي، غير الترميز جزيئات الحمض النووي الريبي. تسلسل ميرناس تطورية حفظت عبر الأنواع، مما يشير إلى أهمية ميرناس في تنظيم الوظائف الفسيولوجية1. ميكرورنا التعبير التنميط وقد ثبت أن تكون مفيدة لتحديد ميرناس التي تعتبر مهمة في تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات، بما في ذلك الاستجابة المناعية، وتمايز الخلية، والعمليات الإنمائية، والمبرمج2. في الآونة الأخيرة، قد تم الاعتراف ميرناس لاحتمال استخدامها في تشخيص الأمراض والمداواة. للباحثين الذين يدرسون آليات لتنظيم الجينات وقياس التعبير ميرنا يمكن أن ينير نماذج النظم مستوى العمليات التنظيمية، لا سيما عندما يتم دمج المعلومات ميرنا مع التنميط مرناً وغيرها بيانات الجينوم-مقياس3. من ناحية أخرى، أظهرت أيضا أن تكون أكثر استقرارا من مرناس في مجموعة من أنواع العينات ميرناس وهي أيضا قابلة للقياس بقدر أكبر من الحساسية من بروتينات4. وادي ذلك إلى اهتمام كبير بتطوير ميرناس كالمؤشرات الحيوية للتطبيقات التشخيصية الجزيئية المختلفة، بما في ذلك أمراض الرئة.
في الرئة، ميرناس دوراً هاما في عملية التنمية والحفاظ على التوازن. وعلاوة على ذلك، قد تم التعبير عنها غير طبيعي المرتبطة بالتنمية والتقدم لمختلف الأمراض الرئوية5. مرض التهاب الرئة الناجمة عن تلوث الهواء قد أثبتت خطورة أكبر والتشخيص الأكثر فقراً في الإناث، مما يشير إلى أن تنظم الهرمونات والدورة الشبقية الرئة الفطرية التعبير الحصانة وميرنا في الاستجابة للتحديات البيئية 6-في هذا البروتوكول، نستخدم التعرض للأوزون، وهو عنصر رئيسي لتلوث الهواء، للحث على شكل من أشكال التهاب الرئة في الفئران الإناث التي تحدث في غياب مناعة التكيفية. باستخدام الأوزون، هي أننا حفز تنمية هايبرريسبونسيفينيس مجرى الهواء الذي يقترن بتلف الخلايا الظهارية مجرى الهواء وزيادة العَدلات ووسطاء التهابات في الخطوط الجوية الدانية7. حاليا، لا توجد بروتوكولات وصف جيد لوصف وتحليل ميرناس عبر دورة الشبقية في الفئران المعرضة للأوزون.
أدناه، ونحن تصف طريقة بسيطة لتحديد مراحل دورة الشبقية والتعبير ميرنا في أنسجة الرئة للفئران الإناث المعرضة للأوزون. علينا أيضا أن تعالج النهج الفعالة المعلوماتية الحيوية لتحديد الهدف واكتشاف ميرنا، مع تركيز على علم الأحياء الحسابي. نحن نحلل البيانات ميكرواري باستخدام ليما، برنامج R/بيوكوندوكتور التي توفر حلاً متكاملا لتحليل البيانات المستمدة من تجارب التعبير الجيني8. تحليل PCR صفيف بيانات من ليما له ميزة من حيث القدرة على اختبار t على أساس الإجراءات عند استخدام عدد صغير من الصفائف/عينات لمقارنة التعبير. لفهم سياق ميرنا التعبير النتائج البيولوجية، ثم استخدام برمجيات التحليل الوظيفي. من أجل فهم الآليات التي تنظم التغييرات النسخي والتنبؤ بالنتائج المحتملة، يجمع البرنامج ميرنا-التعبير مجموعات البيانات والمعارف من الأدب9. هذه هي ميزة مقارنة مع البرامج التي تبحث فقط عن تخصيب الإحصائية في تداخل لمجموعات من ميرناس.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

التنميط ميكرورنا (ميرنا) أصبحت ذات الأهمية للباحثين العاملين في مختلف مجالات البحوث في علم الأحياء والطب. وتبين الدراسات الحالية واعدة مستقبلا من استخدام ميرناس في التشخيص ورعاية أمراض الرئة. هنا، علينا أن نحدد بروتوكول لميرنا التنميط لقياس الوفرة النسبية لمجموعة من ميرناس وتوقع لتنظيم الجينات التهاب في أنسجة الرئة من طراز الماوس التهاب مجرى الهواء الناجم عن الأوزون. لأنه قد ثبت أن تعميم مستويات هرمون الجنس يمكن أن تؤثر على تنظيم الحصانة الفطرية الرئة لدى الإناث، والغرض من هذا الأسلوب وصف ميرنا تحريضية التنميط البروتوكول في الفئران الإناث، آخذا في الاعتبار دورة الشبقية مرحلة كل حيوان في وقت التعرض للأوزون. ونحن أيضا معالجة النهج المعلوماتية المطبقة على ميرنا الاكتشاف والهدف التعرف على أساليب استخدام ليما، برنامج البحث والتطوير/بيوكوندوكتور، والمقترنة ببرامج التحليل الوظيفي لفهم السياق البيولوجي ومسارات التعبير ميرنا التفاضلية.

تستخدم أنواع مختلفة من الخلية لوحظ في مسحات لتحديد مرحلة دورة الشبقية الماوس (الشكل 1). يتم تعريف هذه بواسطة مورفولوجيا الخلايا. أثناء بروستروس، خلايا حصرا تقريبا مجموعات مستدير، وشكل جيد الأنوية الخلايا الظهارية (الشكل 1A). عندما يكون الما...

Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

ميكرورنا الرئة "التنميط عبر الشبقية دورة" في الفئران المعرضة للأوزون

هنا يمكننا وصف أسلوب تقييم التعبير الرئة من ميرناس التي من المتوقع لتنظيم الجينات التحريضية استخدام الفئران المعرضة للأوزون أو تصفية الهواء في مراحل مختلفة من دورة الشبقية.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مناعة الرئة حول كيفية تقييم التعبير عن microRNAs التي من المتوقع تنظيم الجينات الالتهابية داخل الرئة. هذه التقنية تقدم طريقة بسيطة لتحديد مساهمات الهرمونات المتداولة في التعبير ميكرورنا الرئة. لتقييم مرحلة الدورة استروس، يدويا كبح جماح فأر أنثى عمرها ثمانية إلى تسعة أسابيع وإدخال غيض من ماصة بلاستيكية 10 ميكرولتر مليئة بالماء النقي جدا في المهبل.تدفق بلطف أربع إلى خمس مرات لجمع عينة، وإيداع تدفق النهائي من السائل المهبلي على شريحة زجاجية. ثم مراقبة تدفق المهبل غير المطّط تحت مجهر خفيف في التكبير 20X. بالنسبة للأوزون والتعرض للهواء الذي تمت تصفيته، ضع أربعة فئران كحد أقصى في واحدة من حاويتين زجاجيتين فرديتين 1.2 لتر مع أغطية شبكية سلكية.وضع حاوية زجاجية واحدة في غرفة الأوزون وواحدة في غرفة تعرض الهواء المصفاة. ثم ضبط تركيز الأوزون إلى جزأين في المليون، وإزالة الحاوية بعد ثلاث ساعات. بعد أربع ساعات من التعرض ، وتطهير سطح الجلد المكشوف من الفأر التجريبي الأول مع 70 ٪ الإيثانول وقطع القفص الصدري لفضح القلب والرئتين.استخدام ملقط لغمر 1.5 ملليلتر RNase خالية من أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة في النيتروجين السائل، و المفاجئة تجميد الرئة المقطوعة في النيتروجين السائل. ثم استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ سحق الأنسجة ل mascerate الرئة كلها، وتقسيم الأنسجة المسحوقة بين اثنين من أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر. بعد حصاد وسحق الرئتين من جميع الحيوانات بنفس الطريقة، إضافة 500 ميكرولترات من thiocyanate guanidinium إلى كل عينة وتجانس تسلسل كل نسيج مع 18، 21، و 23s قياس الإبر.بعد التجانس الأخير، إضافة 500 ميكرولترات من الإيثانول إلى كل عينة قبل دوامة لمدة 15 ثانية. تحميل المخاليط في أعمدة تدور الفردية في أنابيب جمع الفردية للطرد المركزي وتجاهل flowthroughs. لعلاج DNase 1، إضافة 400 ميكرولترات من العازلة غسل RNA إلى كل عمود للطرد المركزي آخر ومزيج خمسة ميكرولترات من DNase 1 و 75 ميكرولترات من الحمض النووي الهضم العازلة لكل عينة في أنابيب خالية من RNase.أضف المزيج مباشرة إلى مصفوفات العمود لاحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعًا بمحلول غسيل مسبق من RNA سعة 400 ميكرولتر يغسل بالطرد المركزي. لrute الجيش الملكي النيبالي، إضافة 35 ميكرولترات من المياه الخالية من DNase RNase مباشرة إلى كل مصفوفة العمود للطرد المركزي النهائي، وقياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي ونقاء كل عينة على مقياس الطيفي. ثم تخزين الجيش الملكي النيبالي في ناقص 80 درجة مئوية.لrnase retrotranscription صغيرة ، إضافة 200 نانوغرام من مجموع RNA في 10 ميكرولترات من محلول الغسيل المسبق إلى أنبوب واحد من عكس مزيج رد فعل النسخ لكل عينة. بعد خلط، لفترة وجيزة الطرد المركزي العينات ووضعها على الجليد حتى حضانة بهم. بعد ذلك، احتضان الأنابيب لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية، تليها حضانة لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية.في نهاية الحضانة الثانية، تمييع CDNA مع 200 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase لكل 20 ميكرولتر رد فعل النسخ العكسي، وإضافة 10 ميكرولترات من كل عينة مزيج رد فعل إلى كل بئر من استجابة مضادة للماوس مسبقة و المناعة الذاتية ميكرورنا مجموعة PCR. يمكن تحديد مرحلة البرونس من خلال وجود خلايا ظهارية مستديرة الشكل وجيدة التكوين. عندما يكون الماوس في مرحلة estrus ، يتم ملاحظة مجموعات معبأة بكثافة من الخلايا الظهارية المشوشة ، وكورنيد ، و الحرشفية في اللطاخة.خلال metestrus ، وينظر إلى الخلايا الظهارية الكورين و polymorphonuclear الكريات البيض. في الوَيَتَرَس، الكريات البيض عموماً أكثر انتشاراً. الحمض النووي الريبي المستخرج من أربع رئات الماوس، كما هو موضح، تظهر تركيزات الحمض النووي تتراوح بين 1198 و 2178 نانوغرام لكل ميكرولتر ومتوسط نسبة A260 إلى A280 بين 2.01 و 2.02، ومتوسط A260 إلى A230 نسبة بين 2.139 و 2.223.في هذا الجدول، يتم عرض تسجيل التغيرات ذات شقين في التعبير ميكرورنا بين الأوزون والفئران المكشوفة الهواء المصفاة. بعد مرشح الهدف ميكرورنا وتحليل الأساسية ل 14 microRNAs، للحصول على نسبة سجل التعبير الكبير وقيم P، يمكن تعيين هذه البيانات من قبل مرشح الهدف ميكرورنا. كما يوفر التحليل الأساسي معلومات حول المسارات الكنسية والأمراض والوظيفة والمنظمين والشبكات.وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام برنامج التحليل الوظيفي لإنتاج تحليل الشبكة التي تبين العلاقة بين microRNAs من الفائدة والجزيئات الأخرى. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم التحقق من دورة estrus يوميا لمدة ثلاث دورات متتالية على الأقل قبل إجراء تجربة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير الجيني التهاب الرئة عبر دورة estrus.بعد ذلك، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الآخرين في مجال مناعة الرئة لاستكشاف آليات تنظيم هرمون الجنس باستخدام نماذج أخرى.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

تحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبية في الفئران SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

قياسات الضغط البطيني الحق الانقباضي في تركيبة مع حصاد الرئة وعينات الأنسجة المناعية في الفئران

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

قياس الحساسية المفرطة المحلية في الفئران

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

التنظيم القائم على الرنا الميكروي من فيروسة بيكورناوية مع الأجسام

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

تقييم للسآمة للخلايا وإيمونومودولاتوري آثار المواد في شرائح البشرية دقة قطع الرئة

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...