Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af tilskud fra NIH K01HL133520 (PS) og K12HD055882 (PS). Forfatterne takke Dr. Joanna Floros for assistance med ozon eksponering eksperimenter.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Penn State University.
1. vurdering af Estrous cyklus scene
<ol><li>Korrekt begrænse en kvindelig C57BL/6 mus (8 – 9 uger gammel) bruger en egenmægtig mus tilbageholdenhed teknik beskrevet i Machholz et al.10.</li>
	<li>Fyld den sterile plastik pipette med 10 μL af ultra rent vand.</li>
	<li>Indføre spidsen af plast pipette i skeden.</li>
	<li>Forsigtigt tømme...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MikroRNA profilering er en fordelagtig teknik til både klovesygediagnosticering og mekanistiske forskning. I dette manuskript definerede vi en protokol for at evaluere udtryk for miRNAs, der er forudsagt til at regulere inflammatoriske gener i lunger af hunmus udsat for ozon i forskellige estrous cyklus faser. Metoder til bestemmelse af estrous cyklus, som metoden visuel genkendelse har været beskrevet16. Men disse stole på engangs målinger, og derfor er upålidelige. Til præcist for at ident...

MicroRNA (miRNAs) er korte (19-25 nukleotider), naturligt forekommende, ikke-kodende RNA molekyler. Sekvenser af miRNAs er evolutionær bevaret på tværs af arter, hvilket tyder på betydningen af miRNAs i reguleringen af fysiologiske funktioner1. microRNA expression profilering har vist sig for at være nyttigt til at identificere miRNAs, der er vigtige i reguleringen af en række processer, herunder immunrespons, Celledifferentiering, udviklingsprocesser og apoptose2. Mere nylig, miRNAs er blevet anerkendt for deres potentielle anvendelse i sygdom diagnostik og terapi. For forskere at studere mekanismer af genregulering, kan måle miRNA udtryk oplyse systemer-niveau modeller af regulerende processer, især når miRNA oplysninger flettes med mRNA profilering og andre genom-skala data3. På den anden side miRNAs har også vist sig at være mere stabil end mRNAs i en vifte af modellen typer og er også målbare med større følsomhed end proteiner4. Dette har ført til betydelig interesse i udviklingen af miRNAs som biomarkører for forskellige molekylære diagnostiske programmer, herunder lungesygdomme.
I lungen spiller miRNAs vigtige roller i udviklingsprocesser og opretholdelsen af homøostase. Derudover har deres unormale udtryk været forbundet med udvikling og progression af forskellige lungesygdomme5. Inflammatorisk lungesygdom forårsaget af luftforurening har vist større sværhedsgrad og dårligere prognose hos kvinder, der angiver, at hormoner og estrous cyklus kan regulere lunge medfødt immunitet og miRNA udtryk som reaktion på miljømæssige udfordringer 6. i denne protokol, vi bruger ozon eksponering, som er en vigtig del af luftforureningen, for at fremkalde en form for lungebetændelse i hunmus, der opstår i mangel af adaptive immunitet. Ved hjælp af ozon, vi inducerende udviklingen af luftvejene hyperresponsivitet, der er forbundet med luftvejene epitelcelle skader og en stigning i neutrofile og inflammatoriske mediatorer i proksimale airways7. Der er i øjeblikket ikke velbeskrevet protokoller til at karakterisere og analysere miRNAs på tværs af estrous cyklus i ozon-eksponerede mus.
Nedenfor beskriver vi en simpel metode til at identificere estrous cyklus faser og miRNA udtryk i lungevæv af hunmus udsat for ozon. Vi tager også fat effektiv Bioinformatik tilgange til miRNA opdagelse og målet identifikation, med en vægt på computational biologi. Vi analyserer microarray data ved hjælp af limma, en R/Bioconductor software, der giver en integreret løsning til at analysere data fra gen expression eksperimenter8. Analyse af PCR array data fra limma har en fordel i forhold til magten over t-test baseret procedurer, når du bruger små antal arrays/prøver for at sammenligne udtryk. For at forstå biologiske forbindelse med miRNA udtryk resultater, brugte vi så funktionel analyse software. For at forstå de mekanismer, der regulerer transcriptional ændringer og forudsige sandsynlige udfald kombinerer softwaren miRNA-udtryk datasæt og viden fra litteratur9. Det er en fordel sammenlignet med software, bare kigge efter statistiske berigelse i overlappende sæt miRNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

MikroRNA (miRNA) profilering er blevet af interesse for forskere, der arbejder i forskellige områder af biologi og medicin. Aktuelle undersøgelser viser en lovende fremtid ved hjælp af miRNAs i diagnosticering og behandling af lungesygdomme. Her, definerer vi en protokol for miRNA profilering for at måle den relative forekomst af en gruppe af miRNAs forudsagt for at regulere inflammatoriske gener i lungevæv fra af en ozon-induceret luftvejs inflammation musemodel. Fordi det har vist sig at cirkulerende sex hormonniveauer kan påvirke reguleringen af lunge medfødt immunitet hos kvinder, er formålet med denne metode at beskrive en inflammatorisk miRNA profilering protokol i hunmus, under hensyntagen til estrous cyklus fase af hvert dyr på tidspunktet for ozon eksponering. Vi også behandle gældende Bioinformatik tilgange til miRNA opdagelse og målet identifikationsmetoder ved hjælp af limma, en R/Bioconductor software, og funktionel analyse software til at forstå de biologiske kontekst og veje i forbindelse med differential miRNA udtryk.

De forskellige celletyper observeret i udstrygningspræparater bruges til at identificere mus estrous cyklus scene (figur 1). Disse identificeres ved celle morfologi. Under proestrus er celler næsten udelukkende klynger af runde-formet, velformede nukleeret epitelceller (figur 1A). Når musen er i stadiet estrus, er celler cornified planocellulære epitelceller, til stede i tætpakkede klynger (figur 1B</str...

Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Lunge mikroRNA profilering på tværs af the Estrous cyklus i ozon-eksponerede mus

Her beskriver vi en metode til at vurdere lunge udtryk af miRNAs, der er forudsagt til at regulere inflammatoriske gener ved hjælp af mus udsættes for ozon eller filtreret luft på forskellige stadier af estrous cyklus.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i lunge-immunitet området om, hvordan man vurderer udtrykket af microRNAs, der forventes at regulere inflammatoriske gener i lungerne. Denne teknik tilbyder den enkle måde at identificere bidrag cirkulerende hormoner til lunge microRNA udtryk. For at vurdere estrous cyklus fase, manuelt begrænse en otte til ni uger gamle kvindelige mus og indføre spidsen af en plastik 10-mikroliter pipette fyldt med ultra rent vand i skeden.Skyl forsigtigt fire til fem gange for at indsamle en prøve, og aflejr den endelige skylning af vaginal væske på et glas dias. Derefter observere den uhæmmede vaginal flush under et lys mikroskop ved 20X forstørrelse. Ved ozon og filtreret lufteksponering anbringes maksimalt fire mus i en af to individuelle 1,2 liters glasbeholdere med trådnetlåg.Sæt en glasbeholder i et ozonkammer og en i et filtreret lufteksponeringskammer. Juster derefter ozonkoncentrationen til to dele pr. million, så beholderen fjernes efter tre timer. Fire timer efter eksponeringen desinficeres den eksponerede hudoverflade af den første eksperimentelle mus med 70% ethanol og skæres væk brystkassen til at udsætte hjertet og lungerne.Brug snævle til at nedsænke et 1,5 milliliter RNase-frit mikrocentrifugerør i det flydende nitrogen, og fastfrys den høstede lunge i det flydende nitrogen. Brug derefter en rustfri stål væv pulverisator til at mascerate hele lungen, og opdele pulveriseret væv mellem to 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør. Efter høst og pulverisering af lungerne fra alle dyrene på samme måde tilsættes 500 mikroliter af guanidinium thiocyanat til hver prøve og sekventielt homogenisere hvert væv med 18, 21 og 23 gauge nåle.Efter den sidste homogenisering tilsættes 500 mikroliter ethanol til hver prøve, før der hvirvles i 15 sekunder. Før blandingerne i individuelle spinsøjler i individuelle opsamlingsrør til centrifugering, og kassér gennemstrømningerne. Til DNase 1-behandling tilsættes 400 mikroliter RNA-vaskebuffer til hver kolonne for endnu en centrifugering, og der blandes fem mikroliter DNase 1 og 75 mikroliter DNA-fordøjelsesbuffer pr. prøve i RNase-frie rør.Tilsæt blandingen direkte til kolonnen matricer for en 15-minutters inkubation ved stuetemperatur, efterfulgt af to 400 microliter RNA forvaske opløsning vasker ved centrifugering. For at fremkalde RNA'et tilsættes der 35 mikroliter DNase RNase-frit vand direkte til hver kolonnematrix for at få en endelig centrifugering, og den samlede RNA-koncentration og renhed af hver prøve måles på et spektrofotometer. Opbevar derefter RNA'et på minus 80 grader Celsius.Ved retrotranscription af små RNase tilsættes 200 nanogram samlet RNA i 10 mikroliter for forvaskeopløsning til et rør af omvendt transskriptionsreaktionsblanding pr. prøve. Efter blanding, kortvarigt centrifuge prøverne og læg dem på is, indtil deres inkubation. Dernæst inkubere rørene i 60 minutter ved 37 grader Celsius, efterfulgt af en fem-minutters inkubation ved 95 grader Celsius.Ved afslutningen af den anden inkubation fortyndes CDNA med 200 mikroliter RNase-frit vand pr. 20 mikroliters omvendt transskriptionsreaktion, og der tilsættes 10 mikroliter af hver reaktionsblandingsprøve til hver brønd af et forudinstalleret museinflammatorisk respons og autoimmun mikroNAM-PCR-system. Den proestrus fase kan identificeres ved tilstedeværelsen af rundformede og velformede nucleated epitelceller. Når musen er i estrus fase, tætpakkede klynger af anucleated, cornified, og planocellulær epitelceller er observeret i smøre.Under metestrus ses cornified epitelceller og polymorfeclear leukocytter. I diestrus, leukocytter er generelt mere udbredt. RNA udvundet af fire muselunger udviser, som påvist, nukleinsyrekoncentrationer mellem 1198 og 2178 nanogram pr. mikroliter og gennemsnitlig a260 til A280-forholdet mellem 2,01 og 2,02 og et gennemsnitligt A260 til A230-forhold mellem 2,139 og 2,223.I denne tabel vises to gange ændringer i mikroRNA-ekspression mellem ozon og filtrerede luftudseende mus. Efter microRNA-målfilter og kerneanalyse for 14 mikroRNA'er kan disse data kortlægges af microRNA-målfilteret for at opnå det signifikante udtrykslogforhold og P-værdierne. Den centrale analyse giver også oplysninger om kanoniske veje, sygdomme og funktion, lovgivere og netværk.Desuden kan den funktionelle analysesoftware bruges til at producere en netværksanalyse, der viser forholdet mellem de mikroRNA'er af interesse og andre molekyler. Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at kontrollere estrus cyklus dagligt i mindst tre på hinanden følgende cyklusser før udførelse af et eksperiment. Efter denne procedure, andre metoder kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om lunge inflammatoriske genekspression på tværs af estrus cyklus.Efter det udvikling, denne teknik banede vejen for andre forskere inden for lunge immunitet at udforske mekanismer af kønshormon regulering ved hjælp af andre modeller.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Højre ventrikels systoliske tryk Målinger i kombination med Harvest of Lung og Immune vævsprøver i mus

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Måling Lokale anafylaksi hos mus

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza virusformering i befrugtede hønseæg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

MicroRNA-baserede Regulering af Picornavirus Tropisme

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Vurdering af den cytotoksiske og immunmodulerende virkninger af stoffer i menneskelige præcision-cut lunge skiver

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering af vært-patogen svar og Vaccine effekt i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...