Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van NIH K01HL133520 (PS) en K12HD055882 (PS). Dr. Joanna Floros bedanken de auteurs voor de hulp met ozon blootstelling experimenten.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Penn State University.
1. beoordeling van de oestrische cyclus stadium
<ol><li>Goed beperken een vrouwelijke C57BL/6 muis (8-9 weken oud) met behulp van de muis van de hand terughoudendheid techniek beschreven in Machholz et al.,10.</li>
	<li>Vul de steriele plastic pipet met 10 μL van ultra zuiver water.</li>
	<li>De tip van de plastic pipet...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MicroRNA profilering is een voordelige techniek voor de diagnose van de ziekte zowel mechanistisch onderzoek. In dit manuscript, hebben we een protocol om te evalueren van de expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen in de longen van vrouwelijke muizen blootgesteld aan ozon in verschillende oestrische cyclus fasen gedefinieerd. Methoden voor de bepaling van de oestrische cyclus, zoals de visuele detectiemethode, zijn beschreven16. Echter dit vertrouwen op eenmali...

microRNAs (miRNAs) zijn korte (19 tot en met 25 nucleotiden), natuurlijke, niet-coderende molecules van RNA. Sequenties van miRNAs zijn evolutionaire bewaard over soorten, hetgeen wijst op het belang van miRNAs bij het reguleren van de fysiologische functies1. microRNA expressie profilering heeft bewezen nuttig zijn voor het identificeren van miRNAs die belangrijk zijn bij de regulering van een verscheidenheid van processen, waaronder de immuunrespons, celdifferentiatie ontwikkelings processen en apoptosis2. Meer recentelijk zijn miRNAs bekroond voor hun potentiële gebruik in diagnose van de ziekte en therapeutics. Voor onderzoekers bestuderen van mechanismen van genregulering, kan meten van miRNA expressie verlichten systemen-niveau modellen van regelgevende processen, vooral wanneer de miRNA informatie wordt samengevoegd met het mRNA profilering en andere gegevens van genoom-schaal3. Aan de andere kant, miRNAs hebben ook aangetoond dat het stabieler dan mRNAs in een scala van soorten van het specimen worden en zijn ook meetbaar met grotere gevoeligheid dan eiwitten4. Dit heeft geleid tot aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van miRNAs als biomarkers voor diverse moleculaire diagnostische toepassingen, met inbegrip van longziekten.
In de Long spelen miRNAs een belangrijke rol in de ontwikkelings processen en het onderhoud van homeostase. Bovendien is hun abnormale expressie geassocieerd met de ontwikkeling en de progressie van verschillende longziekten5geweest. Inflammatoire longziekte geïnduceerd door luchtverontreiniging blijkt grotere ernst en slechtere prognose bij vrouwtjes, die aangeeft dat de hormonen en de oestrische cyclus Long aangeboren immuniteit en miRNA expressie in reactie op de uitdagingen op milieugebied kunnen regelen 6. in dit protocol, gebruiken we ozon blootstelling, dat een belangrijk onderdeel van de luchtverontreiniging is, voor het opwekken van een vorm van Long ontsteking in vrouwelijke muizen dat zich bij het ontbreken van adaptieve immuniteit voordoet. Met behulp van ozon, zijn wij de ontwikkeling van hyperresponsiveness van de luchtwegen die wordt geassocieerd met luchtweg epitheliale celbeschadiging en een toename van de neutrofielen en inflammatoire mediatoren in proximale airways7inducerende. Er zijn op dit moment niet goed beschreven protocollen te karakteriseren en miRNAs over de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen analyseren.
Hieronder beschrijven we een eenvoudige methode om oestrische cyclus stadia en miRNA expressie in longweefsel van vrouwelijke muizen blootgesteld aan ozon te identificeren. Wij richten ook effectief bioinformatics benaderingen van miRNA ontdekking en target identificatie, met de nadruk op computationele biologie. We analyseren de microarray gegevens met behulp van limma, een R/Bioconductor-software die voorziet in een geïntegreerde oplossing voor het analyseren van de gegevens van gen expressie experimenten8. Analyse van PCR array gegevens uit limma heeft een voordeel in termen van macht over t-test gebaseerd procedures bij het gebruik van kleine aantal arrays/samples te vergelijken van expressie. Te begrijpen de biologische context van miRNA expressie resultaten, we dan de functionele analysesoftware gebruikt. Om de mechanismen tot regeling van transcriptionele veranderingen te begrijpen en te voorspellen waarschijnlijk resultaten, wordt de software combineert miRNA-expressie datasets en kennis van de literatuur9. Dit is een voordeel in vergelijking met software die kijk voor statistische verrijking in overlappende sets van miRNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

MicroRNA (miRNA) profilering is geworden van belang aan onderzoekers werken in verschillende onderzoeksgebieden van biologie en geneeskunde. Huidige studies tonen een veelbelovende toekomst van het gebruik van miRNAs in de diagnose en behandeling van longziekten. Hier definiëren we een protocol voor miRNA profilering voor het meten van de relatieve overvloed van een groep miRNAs voorspeld te reguleren van inflammatoire genen in het longweefsel uit van een ozon-geïnduceerde luchtweg ontsteking muismodel. Omdat het heeft aangetoond dat circulerende sex-hormoonniveaus kan invloed hebben op de regulering van de aangeboren immuniteit longkanker bij vrouwen, is het doel van deze methode voor het beschrijven van een inflammatoire miRNA profilering protocol in vrouwelijke muizen, rekening houdend met de oestrische cyclus fase van elk dier op het moment van blootstelling van de ozon. We pakken ook toepassing bioinformatics benaderingen van miRNA ontdekking en target identificatie methodes gebruikend het limma, een R/Bioconductor-software, en functionele analysesoftware te begrijpen van de context van de biologische en de trajecten die zijn gekoppeld aan differentiële miRNA expressie.

De verschillende soorten cellen waargenomen in de uitstrijkjes zijn gebruikt ter identificatie van de muis oestrische cyclus stadium (Figuur 1). Deze worden geïdentificeerd door de morfologie van de cel. Tijdens proestrus zijn cellen bijna uitsluitend clusters van rond-gevormde, goedgevormde genucleëerde epitheliale cellen (figuur 1A). Wanneer de muis in de estrus fase is, zijn cellen cornified squamous epitheliaale cellen, aan...

Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Long microRNA profilering in de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen

Hier beschrijven we een methode voor de beoordeling van de Long-expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen met behulp van muizen blootgesteld aan ozon of gefilterde lucht in verschillende stadia van de oestrische cyclus.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van longimmuniteit over hoe de expressie van microRNAs die worden voorspeld om ontstekingsgenen in de longen te reguleren, te beoordelen. Deze techniek biedt de eenvoudige manier voor het identificeren van de bijdragen van circulerende hormonen aan longmicroRNA expressie. Om de estrous cyclus fase te beoordelen, handmatig beperken een acht tot negen weken oude vrouwelijke muis en de invoering van het puntje van een plastic 10-microliter pipet gevuld met ultra zuiver water in de vagina.Spoel voorzichtig vier tot vijf keer om een monster te verzamelen en de laatste spoeling van vaginale vloeistof op een glazen glijbaan te deponeren. Observeer vervolgens de onbevlekte vaginale flush onder een lichtmicroscoop bij vergroting van 20x. Voor ozon en gefilterde luchtblootstelling, plaats een maximum van vier muizen in een van de twee individuele 1,2 liter glazen containers met gaasdeksels.Zet een glazen container in een ozonkamer en een in een gefilterde lucht blootstelling kamer. Pas vervolgens de ozonconcentratie aan op twee delen per miljoen en verwijder de container na drie uur. Vier uur na blootstelling desinfecteert u het blootgestelde huidoppervlak van de eerste experimentele muis met 70% ethanol en snijdt u de ribbenkast weg om het hart en de longen bloot te leggen.Gebruik tangen om een 1,5 milliliter RNase-vrije microcentrifugebuis in de vloeibare stikstof onder te dompelen en de geoogste long in de vloeibare stikstof te bevriezen. Gebruik vervolgens een roestvrij stalen weefsel verpulveraar om de hele long mascerate, en split het verpulverde weefsel tussen twee 1,5 milliliter microcentrifuge buizen. Na het oogsten en verpulveren van de longen van alle dieren op dezelfde manier, voeg 500 microliter guanidinium thiocyanaat aan elk monster en achtereenvolgens homogeniseren elk weefsel met 18, 21, en 23 meter naalden.Voeg na de laatste homogenisatie 500 microliter ethanol toe aan elk monster voordat u gedurende 15 seconden gaat wervelen. Laad de mengsels in afzonderlijke draaikolommen in afzonderlijke opvangbuizen voor centrifugatie en gooi de stroomdoorvoer weg. Voor DNase 1-behandeling voegt u 400 microliters RNA-wasbuffer toe aan elke kolom voor nog een centrifugatie en meng vijf microliters van DNase 1 en 75 microliter DNA-vergistingsbuffer per monster in RNase-vrije buizen.Voeg het mengsel direct toe aan de kolommatrices voor een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee 400 microliter RNA voorwasoplossing wast door centrifugatie. Om het RNA te ontwijken, voeg je 35 microliters DNase RNase-vrij water rechtstreeks toe aan elke kolommatrix voor een laatste centrifugatie, en meet je de totale RNA-concentratie en -zuiverheid van elk monster op een spectrofotometer. Bewaar het RNA dan op min 80 graden Celsius.Voor retrotranscription van kleine RNase, voeg 200 nanogram van totale RNA in 10 microliters van prewash oplossing aan een buis van omgekeerde transcriptie reactie mix per monster. Na het mengen, kort centrifugeren de monsters en leg ze op ijs tot hun incubatie. Vervolgens, incubeer de buizen voor 60 minuten op 37 graden Celsius, gevolgd door een vijf minuten incubatie op 95 graden Celsius.Verdun de CDNA aan het einde van de tweede incubatie met 200 microliters RNase-vrij water per 20 microliter reverse transcriptiereactie en voeg 10 microliter van elk reactiemixmonster toe aan elke bron van een voorgeladen ontstekingsreactie van de muis en de micro-PCR-array voor autoimmunityRNA. Het proestrusstadium kan worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van ronde en goed gevormde epitheelcellen. Wanneer de muis zich in het estrusstadium bevindt, worden dicht verpakte clusters van geïucleeerde, cornified en plaveiselmoniële cellen waargenomen in het uitstrijkje.Tijdens metestrus worden cornified epitheelcellen en polymororische leukocyten gezien. In diestrus komen leukocyten over het algemeen vaker voor. RNA, dat uit vier muizenlongen wordt gewonnen, vertonen, zoals aangetoond, nucleïnezuurconcentraties variërend tussen 1198 en 2178 nanogram per microliter en gemiddelde A260-A280-verhouding tussen 2,01 en 2,02, en een gemiddelde A260-A230-verhouding tussen 2.139 en 2.223.In deze tabel worden tweevoudige veranderingen in microRNA-expressie tussen ozon en gefilterde luchtgeblote muizen weergegeven. Na microRNA-doelfilter en kernanalyse voor 14 microRNAs, om de significante expressielogratio en P-waarden te verkrijgen, kunnen deze gegevens in kaart worden gebracht door het microRNA-doelfilter. De kernanalyse biedt ook informatie over canonieke trajecten, ziekten en functies, regelgevers en netwerken.Verder kan de functionele analysesoftware worden gebruikt om een netwerkanalyse te produceren die de relatie laat zien tussen de microRNAs van belang en andere moleculen. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om de estruscyclus dagelijks gedurende ten minste drie opeenvolgende cycli te controleren voordat u een experiment uitvoert. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd om aanvullende vragen over longontstekingsgenexpressie in de estruscyclus te beantwoorden.Na de ontwikkeling, deze techniek de weg vrijgemaakt voor andere onderzoekers op het gebied van longimmuniteit om mechanismen van geslachtshormoon regulering met behulp van andere modellen te verkennen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis in SJL Muizen

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Rechter ventrikel systolische druk Metingen in combinatie met Harvest van Lung en Immune weefselmonsters in Muizen

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Meten Lokaal Anafylaxie in Muizen

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

MicroRNA-gebaseerde verordening van Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...