Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Cette recherche a été financée par des subventions de NIH K01HL133520 (PS) et K12HD055882 (PS). Les auteurs remercient Dr Joanna Floros pour l’aide avec les expériences d’exposition de l’ozone.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de la Penn State University.
1. évaluation de la phase du Cycle oestral
<ol><li>Bien retenir une femelle souris C57BL/6 (8-9 semaines) en utilisant la technique de retenue une main souris décrite dans Machholz et al.,10.</li>
	<li>Remplir la pipette en plastique stérile avec 10 μL d’eau ultra pure.</li>
	<li>Introduire l’embout de la pipette ...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. 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W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

Profilage de microARN est une technique avantageuse pour diagnostic des maladies et recherches mécanistes. Dans ce manuscrit, nous avons défini un protocole visant à évaluer l’expression des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires dans les poumons des souris femelles exposées à l’ozone dans le cycle oestral différents stades. Méthodes pour la détermination du cycle oestral, telles que la méthode de détection visuelle, ont été décrits16. Cependant, ceux-ci s?...

microARN (miARN) sont courts (19 à 25 nucléotides), naturels, non codantes des molécules d’ARN. Séquences de miARN sont évolutifs conservé selon les espèces, ce qui suggère l’importance des miARN dans la régulation des fonctions physiologiques1. profil d’expression des micro-ARN a été prouvé pour être utile pour identifier les miARN qui sont importants dans la régulation de divers processus, y compris la réponse immunitaire, différenciation cellulaire, processus de développement et l’apoptose2. Plus récemment, les miARN ont été reconnus pour leur utilisation potentielle dans le diagnostic de la maladie et la thérapeutique. Pour les chercheurs qui étudient les mécanismes de régulation génique, mesurant miRNA expression peut éclairer des modèles de systèmes au niveau des processus réglementaires, surtout quand les informations de miRNA sont fusionnées avec le profilage d’ADN messagère et autres données de génome-échelle3. En revanche, miARN ont également montré à être plus stables que les ARNm dans un éventail de types de spécimens et est également mesurables avec une plus grande sensibilité que les protéines4. Cela a conduit à un intérêt considérable dans le développement des miARN comme biomarqueurs pour diverses applications de diagnostiques moléculaires, y compris les maladies pulmonaires.
Dans le poumon, miRNAs jouent un rôle important dans le processus de développement et le maintien de l’homéostasie. En outre, leur expression anormale a été associée à l’apparition et la progression de diverses maladies pulmonaires5. La pneumopathie inflammatoire induite par la pollution de l’air a démontré une plus grande sévérité et pronostic moins favorable chez les femelles, ce qui indique que les hormones et le cycle oestral peuvent réglementer pulmonaire innée immunité et miRNA expression en réponse aux défis environnementaux 6. dans le présent protocole, nous utilisons exposition à l’ozone, qui est une composante majeure de la pollution atmosphérique, pour induire une forme d’inflammation des poumons chez les souris femelles qui se produit en l’absence d’immunité adaptative. En utilisant l’ozone, nous sommes induisant le développement d’hyperréactivité bronchique associé à la lésion des cellules épithéliales des voies respiratoires et une augmentation des neutrophiles et des médiateurs inflammatoires en proximal airways7. Actuellement, il n’y a pas des protocoles bien décrits pour caractériser et analyser des miARN tout le cycle oestral chez des souris exposées à l’ozone.
Ci-dessous, nous décrivons une méthode simple pour identifier les étapes du cycle oestral et miRNA expression dans les tissus pulmonaires chez des souris femelles exposées à l’ozone. Nous abordons également approches bioinformatiques efficace miRNA découverte et cible d’identification, en mettant l’accent sur la biologie computationnelle. Nous analysons les données microarray à l’aide de Leduc, un logiciel R/Bioconductor qui offre une solution intégrée d’analyse de données d’expression de gène des expériences8. Analyse des données de tableau PCR de Leduc a un avantage en termes de puissance sur les procédures de test t basé lorsque vous utilisez le petit nombre de tableaux/échantillons pour comparer l’expression. Pour comprendre le contexte biologique miRNA des résultats d’expression, nous avons ensuite utilisé le logiciel d’analyse fonctionnelle. Afin de comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelles changements et pour prédire les résultats probables, le logiciel combine les datasets miRNA-expression et connaissance de la littérature9. Il s’agit d’un avantage par rapport aux logiciels qu’il suffit de regarder pour l’enrichissement statistique dans le recoupement d’ensembles des miARN.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

Profilage de microARN (miARN) est devenu d’intérêt pour les chercheurs qui travaillent dans divers domaines de recherche de biologie et de médecine. Les études actuelles montrent un prometteur future de l’utilisation des miARN dans le diagnostic et le soin des maladies pulmonaires. Ici, nous définissons un protocole pour miRNA profilage pour mesurer l’abondance relative d’un groupe des miARN prévues pour réguler les gènes inflammatoires dans le tissu pulmonaire, partir d’un modèle de souris de l’inflammation des voies respiratoires induite par l’ozone. Parce qu’il a été démontré que les niveaux de l’hormone sexuelle peuvent influer sur la régulation de l’immunité innée pulmonaire chez les femelles, cette méthode vise à décrire un miRNA inflammatoire protocole chez les souris femelles, prenant en considération le cycle oestral de profilage stade de chaque animal au moment de l’exposition à l’ozone. Nous abordons également approches bioinformatiques applicable miRNA découverte et cible méthodes d’identification Leduc, un logiciel R/Bioconductor, et logiciel d’analyse fonctionnelle pour comprendre le contexte biologique et les voies associées expression différentielle de miRNA.

Les différents types cellulaires observés dans les frottis sont utilisés pour identifier l’étape de cycle oestral de la souris (Figure 1). Ceux-ci sont identifiés par la morphologie des cellules. Au cours du proestrus, cellules sont presque exclusivement des amas de cellules épithéliales nucléées (Figure 1 a) forme ronde, bien formées. Lorsque la souris est dans la phase d’oestrus, les cellules sont des cellules ép...

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Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Poumon microARN profilage à travers le œstrus chez les souris exposées à l’Ozone

Nous décrivons ici une méthode pour évaluer l’expression de poumon des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires utilisant des souris exposées à l’ozone ou de l’air filtré à différents stades du cycle oestral.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’immunité pulmonaire sur la façon d’évaluer l’expression des microARN qui sont prévus pour réguler les gènes inflammatoires dans le poumon. Cette technique offre le moyen simple d’identifier les contributions des hormones circulantes à l’expression des microARN pulmonaires. Pour évaluer le stade du cycle estrous, retenez manuellement une souris femelle de huit à neuf semaines et introduisez la pointe d’une pipette en plastique de 10 microlitres remplie d’eau ultra pure dans le vagin.Rincer délicatement quatre à cinq fois pour recueillir un échantillon et déposer la dernière bouffée de liquide vaginal sur une glissière en verre. Ensuite, observez la chasse vaginale non tachée sous un microscope léger au grossissement 20X. Pour les expositions à l’ozone et à l’air filtré, placez un maximum de quatre souris dans l’un des deux contenants individuels en verre de 1,2 litre avec couvercles en maille métallique.Mettez un récipient en verre dans une chambre d’ozone et un dans une chambre filtrée d’exposition à l’air. Réglez ensuite la concentration d’ozone à deux parties par million, en enlevant le récipient après trois heures. Quatre heures après l’exposition, désinfectez la surface de peau exposée de la première souris expérimentale avec 70% d’éthanol et coupez la cage thoracique pour exposer le cœur et les poumons.Utilisez des forceps pour plonger un tube de micro centrifugeuse sans RNase de 1,5 millilitre dans l’azote liquide et casser le poumon récolté dans l’azote liquide. Ensuite, utilisez un pulvérisateur de tissu en acier inoxydable pour mascerate l’ensemble du poumon, et diviser le tissu pulvérisé entre deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Après avoir récolté et pulvérisé les poumons de tous les animaux de la même manière, ajoutez 500 microlitres de thiocyanate de guanidinium à chaque échantillon et homogénéisez séquentiellement chaque tissu avec des aiguilles de calibre 18, 21 et 23.Après la dernière homogénéisation, ajouter 500 microlitres d’éthanol à chaque échantillon avant de vortexer pendant 15 secondes. Chargez les mélanges dans des colonnes de spin individuelles dans des tubes de collecte individuels pour la centrifugation et jetez les écoulements. Pour le traitement DNase 1, ajouter 400 microlitres de tampon de lavage d’ARN à chaque colonne pour une autre centrifugation et mélanger cinq microlitres de DNase 1 et 75 microlitres de tampon de digestion de l’ADN par échantillon dans les tubes sans RNase.Ajouter le mélange directement aux matrices de colonne pour une incubation de 15 minutes à température ambiante, suivie de deux lavages de solution de prélavage d’ARN de 400 microlitres par centrifugation. Pour élucider l’ARN, ajouter 35 microlitres d’eau sans DNase RNase directement à chaque matrice de colonne pour une centrifugation finale, et mesurer la concentration totale d’ARN et la pureté de chaque échantillon sur un spectrophotomètre. Ensuite, stockez l’ARN à moins 80 degrés Celsius.Pour la rétrotranscription de la petite RNase, ajouter 200 nanogrammes d’ARN total dans 10 microlitres de solution de prélavage à un tube de mélange de réaction de transcription inverse par échantillon. Après le mélange, centrifugez brièvement les échantillons et placez-les sur la glace jusqu’à leur incubation. Ensuite, incuber les tubes pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius, suivie d’une incubation de cinq minutes à 95 degrés Celsius.À la fin de la deuxième incubation, diluer le CDNA avec 200 microlitres d’eau sans RNase par réaction de transcription inverse de 20 microlitres, et ajouter 10 microlitres de chaque échantillon de mélange de réaction à chaque puits d’une réponse inflammatoire préchargée de souris et d’un tableau pcr microARN auto-immunité. Le stade proéstrus peut être identifié par la présence de cellules épithéliales nucléées rondes et bien formées. Lorsque la souris est au stade de l’estrus, des amas densément emballés de cellules épithéliales anucléifiées, cornifiées et squameuses sont observés dans le frottis.Pendant les métastrus, on voit des cellules épithéliales cornifiées et des leucocytes polymorphonucléaires. Chez les diestrus, les leucocytes sont généralement plus répandus. L’ARN extrait de quatre poumons de souris, comme démontré, présentent des concentrations d’acide nucléique variant entre 1198 et 2178 nanogrammes par microlitre et un rapport moyen A260/A280 entre 2,01 et 2,02, et un rapport moyen A260/A230 entre 2.139 et 2.223.Dans ce tableau, les changements doubles de l’expression du microARN entre l’ozone et les souris exposées à l’air filtré sont indiqués. Après le filtre cible microARN et l’analyse de base de 14 microARN, afin d’obtenir le rapport de journal d’expression significatif et les valeurs P, ces données peuvent être cartographiées par le filtre cible microARN. L’analyse de base fournit également de l’information sur les voies canoniques, les maladies et la fonction, les organismes de réglementation et les réseaux.En outre, le logiciel d’analyse fonctionnelle peut être utilisé pour produire une analyse réseau qui montre la relation entre les microARN d’intérêt et d’autres molécules. Tout en essayant cette procédure, il est important de vérifier le cycle de l’estrus quotidiennement pendant au moins trois cycles consécutifs avant de mener une expérience. Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être exécutées pour répondre à des questions supplémentaires au sujet de l’expression inflammatoire de gène de poumon à travers le cycle d’estrus.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à d’autres chercheurs dans le domaine de l’immunité pulmonaire pour explorer les mécanismes de régulation des hormones sexuelles en utilisant d’autres modèles.

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