Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH K01HL133520 (PS) ו K12HD055882 (PS). המחברים מודים ד ר ג'ואנה Floros על הסיוע עם האוזון חשיפה ניסויים.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של פן סטייט.
1. הערכה של השלב ייחום
<ol><li>כמו שצריך לרסן נקבה העכבר C57BL/6 (בן 8 – 9 שבועות) באמצעות העכבר ביד אחת איפוק בטכניקה המתוארת et al. Machholz10.</li>
	<li>למלא את פיפטה פלסטיק סטרילית עם 10 ?...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

פרופיל MicroRNA היא טכניקה יתרון לאבחון המחלה והן מכניסטית מחקר. כתב יד זה, הגדרנו פרוטוקול להעריך את הביטוי של miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים בריאות של עכברים הנשי נחשפים האוזון בשלבים שונים ייחום. שיטות לקביעת ייחום, כגון שיטת זיהוי חזותי, כבר מתואר16. עם זאת, אלה מסתמכים על מדי...

Rna (miRNAs) הם קצרים (19-25 נוקלאוטידים), המתרחשים באופן טבעי, ללא קידוד RNA מולקולות. רצפים של miRNAs הם אבולוציונית והתפאורה על פני מינים, רומז על חשיבות miRNAs בוויסות פונקציות פיזיולוגיים1. יצירת פרופיל ביטוי microRNA הוכח להיות מועיל לזיהוי miRNAs חשובים בוויסות מגוון רחב של תהליכים, כולל את התגובה החיסונית, התמיינות תאים, תהליכים פיתוחיים אפופטוזיס2. לאחרונה, miRNAs זוהו לשימוש שלהם פוטנציאל אבחון המחלה הרפוי. עבור החוקרים ללמוד מנגנונים של הכונה, מדידה miRNA ביטוי יכול להאיר את מערכות ברמת מודלים של תהליכים רגולטוריים, במיוחד כאשר miRNA המידע יאוחד עם פרופיל ה-mRNA, אחרים נתונים הגנום בקנה מידה3. מצד שני, miRNAs יש גם הוכח להיות יציבים יותר mRNAs במגוון סוגי הדגימה, גם הם מדידה עם רגישות גדולה יותר מאשר חלבונים4. זה הוביל עניין רב בהתפתחות miRNAs כמו סמנים ביולוגיים עבור יישומים אבחון מולקולרי שונים ומגוונים, לרבות מחלות ריאה.
הריאות, miRNAs משחק תפקידים חשובים תהליכים התפתחותיים, שמירה על הומאוסטזיס. יתר על כן, ביטוי לא תקין שלהם נמצא קשור פיתוח, ההתקדמות של מחלות שונות5. מחלות ריאה דלקתיות הנגרמת על ידי זיהום אוויר הוכיחה ביתר חומרה והפרוגנוזה עניים אצל נקבות, המציין הורמוני, את ייחום יכול לווסת את הריאה מולדת חסינות miRNA הבעה בתגובה אתגרים סביבתיים 6. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים באוזון חשיפה, המהווה מרכיב עיקרי של זיהום אוויר, לזירוז צורה של דלקת ריאות בעכברים הנשית המתרחשת בהעדר חסינות מסתגלת. באמצעות אוזון, אנחנו נמצאים גרימת הפיתוח של hyperresponsiveness דרכי הנשימה המשויך נזק תאי אפיתל דרכי הנשימה, עלייה נויטרופילים, מתווכים דלקתיים ב איירווייז proximal7. כיום, ישנם לא פרוטוקולים היטב תיאר לאפיין ולנתח miRNAs מעבר ייחום בעכברים החשופים האוזון.
להלן, אנו מתארים שיטה פשוטה כדי לזהות ייחום שלבים וביטוי miRNA ברקמת הריאה של עכברים הנשי נחשפים האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה יעיל זיהוי גילוי של היעד miRNA, עם דגש על ביולוגיה חישובית. אנחנו מנתחים את הנתונים microarray באמצעות limma, יש תוכנה R/Bioconductor אשר מספק פתרון משולב עבור ניתוח נתונים ניסויים של ביטוי גנים8. ניתוח של נתונים מערך ה-PCR limma יש יתרון מבחינת צריכת חשמל על הליכים לפי מבחן t כאשר באמצעות מספר קטן של מערכים/דוגמאות כדי להשוות את הביטוי. כדי להבין את ההקשר הביולוגי של תוצאות הביטוי miRNA, אז השתמשנו בתוכנה אנליזה פונקציונלית. על מנת להבין את מנגנוני ויסות שינויים תעתיק לחזות תוצאות סביר, התוכנה משלב miRNA-ביטוי datasets וידע הספרות9. זהו יתרון בהשוואה עם התוכנה פשוט תחפש העשרה סטטיסטי ב חופפים סטים של miRNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

פרופיל MicroRNA (miRNA) הפך לעניין חוקרים עובדים בתחומים שונים מחקר בביולוגיה ורפואה. מחקרים הנוכחי מראים התחלה מבטיחה בעתיד הכרוכים miRNAs באבחון, טיפול של מחלות ריאה. . כאן, אנחנו להגדיר עבור miRNA פרופיל כדי למדוד את השפע היחסי של קבוצת miRNAs חזה להסדיר גנים דלקתיים רקמת הריאה של מודל העכבר דלקת דרכי הנשימה אוזון-induced פרוטוקול. כי הוכח כי במחזור רמות הורמון המין יכול להשפיע ברגולציה של הריאה מולדת חסינות אצל נקבות, מטרת שיטה זו היא לתאר את miRNA דלקתיות של פרופיל פרוטוקול בעכברים נקבה, אם לוקחים בחשבון את ייחום שלב של כל בעל חיים בזמן החשיפה האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה ישים miRNA של גילוי ושל יעד שיטות זיהוי באמצעות limma, תוכנה R/Bioconductor, ו אנליזה פונקציונלית תוכנה כדי להבין את ההקשר הביולוגי ואת מסלולים הקשורים ביטוי דיפרנציאלי miRNA.

סוגי תאים שונים שנצפתה מריחות משמשים לזיהוי השלב ייחום העכבר (איור 1). אלו מזוהים על ידי תא מורפולוגיה. במהלך proestrus, תאים הם באופן כמעט בלעדי אשכולות של צורת עגול, בנוי היטב nucleated לתאי האפיתל (איור 1 א'). כאשר העכבר נמצא בשלב ייחום, תאים הם cornified ...

Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

כאן אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי ריאות miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים שימוש בעכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר בשלבים שונים של ייחום.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חסינות ריאות על איך להעריך את הביטוי של microRNAs כי הם צפויים לווסת גנים דלקתיים בתוך הריאה. טכניקה זו מציעה את הדרך הפשוטה לזיהוי התרומות של הורמונים במחזור ביטוי microRNA ריאות. כדי להעריך את שלב מחזור estrous, לרסן באופן ידני עכבר נקבה בן שמונה עד תשעה שבועות ולהציג את הקצה של פיפטה פלסטיק 10 מיקרוליטר מלא מים טהורים במיוחד לתוך הנרתיק.יש לשטוף בעדינות ארבע עד חמש פעמים כדי לאסוף דגימה, ולהפקיד את הסומק הסופי של נוזל הנרתיק על מגלשת זכוכית. לאחר מכן התבונן סומק הנרתיק מוכתם תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 20X. לחשיפות לאוזון ואוויר מסונן, מניחים עד ארבעה עכברים באחד משני מיכלי זכוכית בודדים באורך 1.2 ליטר עם מכסי רשת תיל.שים מיכל זכוכית אחד בתא אוזון ואחד בתא חשיפה לאוויר מסונן. לאחר מכן להתאים את ריכוז האוזון לשני חלקים למיליון, הסרת המיכל לאחר שלוש שעות. ארבע שעות לאחר החשיפה, לחטא את פני העור החשופים של העכבר הניסיוני הראשון עם 70% אתנול לחתוך את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות.השתמש מדפים כדי לטבול 1.5 מיליליטר RNase ללא צינור מיקרו צנטריפוגה בחנקן הנוזלי, ו הצמד להקפיא את הריאה שנקטפה בחנקן הנוזלי. לאחר מכן השתמש pulverizer רקמת נירוסטה כדי mascerate את הריאה כולה, ולפצל את הרקמה מרוסקת בין שני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר קצירת ומרסק את הריאות מכל בעלי החיים באותו אופן, להוסיף 500 microliters של guanidinium thiocyanate לכל מדגם ברצף הומוגניזציה כל רקמה עם 18, 21, ו 23 מחטי מד.לאחר ההומוגניזציה האחרונה, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אתנול לכל דגימה לפני המערבולת במשך 15 שניות. טוענים את תערובות לתוך עמודי ספין בודדים בצינורות איסוף בודדים עבור צנטריפוגה להשליך את flowthroughs. לטיפול DNase 1, להוסיף 400 microliters של מאגר לשטוף RNA לכל עמודה עבור צנטריפוגה אחרת לערבב חמישה microliters של DNase 1 ו 75 microliters של מאגר עיכול DNA לכל מדגם צינורות RNase חינם.מוסיפים את התערובת ישירות למטריצה הטורית עבור דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריה שתי 400 תותחי RNA מיקרוליטר שטיפת מראש על ידי צנטריפוגה. כדי לחמק מה-RNA, הוסיפו 35 מיקרוליטרים של מים נטולי DNase RNase ישירות לכל מטריצת עמודה לצנטריפוגה סופית, ולמדוד את הריכוז והטוהר הכוללים של ה-RNA של כל דגימה על ספקטרופוטומטר. לאחר מכן לאחסן את RNA במינוס 80 מעלות צלזיוס.לקבלת retrotranscription של RNase קטן, להוסיף 200 ננוגרם של RNA הכולל ב 10 microliters של פתרון prewash לצינור אחד של תערובת תגובת שעתוק הפוך לכל מדגם. לאחר ערבוב, לזמן קצר צנטריפוגה הדגימות מניחים אותם על קרח עד הדגירה שלהם. לאחר מכן, הדגירה את הצינורות במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריו דגירה של חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה השנייה, לדלל את CDNA עם 200 microliters של מים ללא RNase לכל 20 תגובת שעתוק הפוך microliter, ולהוסיף 10 microliters של כל מדגם תערובת תגובה לכל באר של תגובה דלקתית עכבר טעון מראש מערך PCR microRNA אוטואימוניות. שלב proestrus יכול להיות מזוהה על ידי נוכחות של תאים אפיתל מעוגל מעוצב היטב. כאשר העכבר נמצא בשלב האסטרוס, אשכולות צפופים של תאי אפיתל משונכים, משופצים ומצווחניים נצפו במריחה.במהלך מטסטרוס, תאי אפיתל קורנווליים ולוקוציטים פולימורפונוקלאר נראים. ב diestrus, לויוציטים הם בדרך כלל נפוצים יותר. RNA המופק מארבע ריאות עכבר, כפי שהוכח, מציג ריכוזי חומצות גרעין הנעים בין 1198 ל-2178 ננוגרם למיקרוליטר ויחס ממוצע של A260 ל-A280 בין 2.01 ל-2.02, ויחס ממוצע בין A260 ל-A230 בין 2.139 ל-2.223.בטבלה זו מוצגים שינויים כפולים בביטוי microRNA בין האוזון לעכברים חשופי אוויר מסוננים. לאחר מסנן יעד microRNA וניתוח ליבה עבור 14 microRNAs, כדי לקבל את יחס יומן הביטוי המשמעותי וערכי P, נתונים אלה יכולים להיות ממופים על ידי מסנן היעד microRNA. ניתוח הליבה מספק גם מידע על מסלולים קנוניים, מחלות ותפקוד, רגולטורים ורשתות.כמו כן, ניתן להשתמש בתוכנת הניתוח הפונקציונלית כדי לייצר ניתוח רשת המציג את הקשר בין microRNAs של עניין ומולקולות אחרות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לבדוק את מחזור estrus מדי יום לפחות שלושה מחזורים רצופים לפני ביצוע ניסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות על ביטוי גנים דלקתיים ריאות לאורך מחזור estrus.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים אחרים בתחום חסינות הריאות לחקור מנגנונים של ויסות הורמון המין באמצעות מודלים אחרים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

מדידות נכונות חדרית סיסטולי לחץ בשילוב עם קציר של ריאה ודגימות רקמה חיסוניות בעכברים

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

תקנה מבוססת MicroRNA של Picornavirus כמיהות

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...