Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

इस अनुसंधान NIH K01HL133520 (पी एस) और K12HD055882 (पी एस) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । लेखकों ने ओजोन एक्सपोजर प्रयोगों के साथ सहायता के लिए डॉ॰ जोआना Floros का धन्यवाद किया ।

यहाँ वर्णित सभी पद्धतियों को पेन स्टेट विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु परिचर्या एवं उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. मद चक्र चरण का मूल्यांकन
<ol><li>ठीक से एक महिला C57BL/6 माउस (8-9 सप्ताह ...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. 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W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MicroRNA profiling दोनों रोग निदान और यंत्रवत अनुसंधान के लिए एक लाभप्रद तकनीक है । इस पांडुलिपि में, हम miRNAs की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल परिभाषित किया है कि विभिन्न मद चक्र चरणों में ओजोन को ...

microRNAs (miRNAs) कम कर रहे है (19 से 25 न्यूक्लियोटाइड), स्वाभाविक रूप से होने वाली, गैर-आरएनए अणु कोडन । miRNAs के अनुक्रम प्रजातियों के पार संरक्षित विकासवादी हैं, शारीरिक कार्यों को विनियमित करने में miRNAs के महत्व का सुझाव1। microRNA अभिव्यक्ति रूपरेखा miRNAs की पहचान करने के लिए उपयोगी साबित किया गया है कि प्रक्रियाओं की एक किस्म के विनियमन में महत्वपूर्ण हैं, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सहित, कोशिका विभेद, विकासात्मक प्रक्रियाओं, और apoptosis2. हाल ही में, miRNAs रोग निदान और चिकित्सकीय में उनके संभावित उपयोग के लिए मांयता प्राप्त किया गया है । जीन विनियमन के तंत्र का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए, miRNA अभिव्यक्ति मापने प्रणालियों विनियामक प्रक्रियाओं के स्तर के मॉडल, विशेष रूप से जब miRNA जानकारी mRNA profiling और अंय जीनोम के साथ विलय कर सकते है स्केल डेटा3। दूसरी ओर, miRNAs भी नमूना प्रकार की एक श्रेणी में mRNAs से अधिक स्थिर होना दिखाया गया है और भी प्रोटीन की तुलना में अधिक से अधिक संवेदनशीलता के साथ मध्यम श्रेणी के4। यह फेफड़ों के रोगों सहित विविध आणविक नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए miRNAs के विकास में काफी रुचि के लिए नेतृत्व किया गया है ।
फेफड़ों में, miRNAs विकास प्रक्रियाओं और homeostasis के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इसके अलावा, उनकी असामांय अभिव्यक्ति के विकास और विभिंन फुफ्फुसीय रोगों के प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है5। वायु प्रदूषण से प्रेरित भड़काऊ फेफड़ों की बीमारी महिलाओं में अधिक से अधिक गंभीरता और गरीब रोग का निदान का प्रदर्शन किया है, यह दर्शाता है कि हार्मोन और मद चक्र पर्यावरणीय चुनौतियों के जवाब में फेफड़ों जंमजात उन्मुक्ति और miRNA अभिव्यक्ति को विनियमित कर सकते हैं 6. इस प्रोटोकॉल में, हम ओजोन जोखिम, जो वायु प्रदूषण का एक प्रमुख घटक है का उपयोग करें, मादा चूहों में फेफड़ों की सूजन का एक रूप प्रेरित है कि अनुकूली उन्मुक्ति के अभाव में होता है । ओजोन का उपयोग करके, हम airway उपकला कोशिका क्षति और समीपस्थ एयरवेज7में न्यूट्रोफिल और भड़काऊ मध्यस्थों में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है कि airway hyperresponsiveness के विकास उत्प्रेरण कर रहे हैं. वर्तमान में, वहां अच्छी तरह से नहीं कर रहे है प्रोटोकॉल का वर्णन करने और ओजोन उजागर चूहों में मद चक्र भर में miRNAs विश्लेषण ।
नीचे, हम एक सरल करने के लिए मद चक्र चरणों और मादा ओजोन के संपर्क में चूहों के फेफड़े के ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति की पहचान विधि का वर्णन । हम भी गणना जीव विज्ञान पर जोर देने के साथ miRNA खोज और लक्ष्य पहचान के लिए प्रभावी bioinformatics दृष्टिकोण का पता । हम limma, एक आर/कंडक्टर सॉफ्टवेयर है कि जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों8से डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक एकीकृत समाधान प्रदान करता है का उपयोग कर microarray डेटा का विश्लेषण । limma से पीसीआर ऐरे डेटा का विश्लेषण शक्ति के मामले में टी परीक्षण आधारित प्रक्रियाओं में एक फायदा है जब arrays की छोटी संख्या का उपयोग कर अभिव्यक्ति की तुलना/ miRNA अभिव्यक्ति परिणामों के जैविक संदर्भ को समझने के लिए, हम तो कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया । आदेश में transcriptional परिवर्तन विनियमन तंत्र को समझने के लिए और संभावना परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए, सॉफ्टवेयर miRNA-अभिव्यक्ति डेटासेट और साहित्य9से ज्ञान को जोड़ती है । यह एक फायदा है जब सॉफ्टवेयर के साथ तुलना में है कि बस miRNAs के सेट के लिए अतिव्यापी में सांख्यिकीय संवर्धन के लिए देखो ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

MicroRNA (miRNA) की रूपरेखा जीव विज्ञान और चिकित्सा के विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की बन गई है. वर्तमान अध्ययन निदान और फेफड़ों के रोगों की देखभाल में miRNAs का उपयोग कर के एक होनहार भविष्य दिखाते हैं । यहां, हम एक ओजोन प्रेरित airway सूजन माउस मॉडल से फेफड़ों के ऊतकों में भड़काऊ जीन को विनियमित करने की भविष्यवाणी की miRNAs के एक समूह के रिश्तेदार बहुतायत को मापने के लिए miRNA रूपरेखा के लिए एक प्रोटोकॉल को परिभाषित । क्योंकि यह दिखाया गया है कि परिसंचारी सेक्स हार्मोन का स्तर महिलाओं में फेफड़े के जन्मजात प्रतिरक्षा के विनियमन को प्रभावित कर सकते हैं, इस विधि का उद्देश्य मादा चूहों में एक भड़काऊ miRNA profiling प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है, ध्यान में मद चक्र लेने ओजोन एक्सपोजर के समय प्रत्येक जानवर की स्टेज । हम भी limma, एक आर/कंडक्टर सॉफ्टवेयर, और कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए miRNA खोज और लक्ष्य पहचान तरीकों को लागू bioinformatics दृष्टिकोण को संबोधित जैविक संदर्भ और साथ जुड़े रास्ते को समझने के लिए विभेद miRNA अभिव्यक्ति ।

धब्बों में मनाया विभिन्न प्रकार के सेल माउस मद चक्र चरण (चित्रा 1) की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है. ये कक्ष आकृति विज्ञान द्वारा पहचाने जाते हैं । proestrus के दौरान, कोशिकाओं को ?...

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Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

फेफड़े microRNA ओजोन-उजागर चूहों में मद चक्र भर में profiling

यहां हम एक विधि का वर्णन करने के लिए miRNAs की फेफड़ों की अभिव्यक्ति का आकलन है कि भड़काऊ जीन को विनियमित चूहों ओजोन या मद चक्र के विभिंन चरणों में फ़िल्टर की गई हवा का उपयोग करने की भविष्यवाणी कर रहे हैं ।

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

यह विधि फेफड़ों के भीतर भड़काऊ जीन को विनियमित करने की भविष्यवाणी करने वाले माइक्रोआरएनए की अभिव्यक्ति का आकलन करने के बारे में फेफड़ों की प्रतिरक्षा क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। यह तकनीक फेफड़ों माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति के लिए परिसंचारी हार्मोन के योगदान की पहचान करने के लिए सरल तरीका प्रदान करता है। एस्ट्रोस चक्र चरण का आकलन करने के लिए, मैन्युअल रूप से एक आठ से नौ सप्ताह पुराने मादा माउस को नियंत्रित करें और योनि में अल्ट्रा शुद्ध पानी से भरे प्लास्टिक 10-माइक्रोलिटर पिपेट की नोक पेश करें।धीरे से एक नमूना इकट्ठा करने के लिए चार से पांच बार फ्लश, और एक गिलास स्लाइड पर योनि तरल पदार्थ के अंतिम फ्लश जमा । फिर 20X आवर्धन पर एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे अन दागदार योनि फ्लश का निरीक्षण करें। ओजोन और फ़िल्टर किए गए एयर एक्सपोजर के लिए, तार जाल ढक्कन के साथ दो व्यक्तिगत 1.2 लीटर ग्लास कंटेनरों में से एक में अधिकतम चार चूहों रखें।एक ओजोन कक्ष में एक गिलास कंटेनर और एक फ़िल्टर एयर एक्सपोजर कक्ष में एक रखो । फिर ओजोन एकाग्रता को प्रति मिलियन दो भागों में समायोजित करें, तीन घंटे के बाद कंटेनर को हटा दें। एक्सपोजर के चार घंटे बाद, 70% इथेनॉल के साथ पहले प्रयोगात्मक माउस की उजागर त्वचा की सतह को कीटाणुरहित करें और दिल और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए रिब पिंजरे को काट दें।तरल नाइट्रोजन में 1.5 मिलीलीटर आरएनएएस-मुक्त माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब को जलमग्न करने के लिए संदंश का उपयोग करें, और तरल नाइट्रोजन में काटे गए फेफड़ों को फ्रीज करें। फिर पूरे फेफड़ों को मस्केरेट करने के लिए स्टेनलेस स्टील टिश्यू पल्वरेराइजर का उपयोग करें, और दो 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के बीच पल्वराइज्ड ऊतक को विभाजित करें। इस तरीके से सभी जानवरों से फेफड़ों की कटाई और स्पंदन करने के बाद, प्रत्येक नमूने में ग्वानिनियम थिओसाइनेट के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रत्येक ऊतक को 18, 21 और 23 गेज सुइयों के साथ क्रमिक रूप से समरूप बनाएं।अंतिम समरूपता के बाद, 15 सेकंड के लिए भंवर से पहले प्रत्येक नमूने में इथेनॉल के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। मिश्रण को अपकेंद्रित्र के लिए व्यक्तिगत संग्रह ट्यूबों में व्यक्तिगत स्पिन कॉलम में लोड करें और प्रवाह को त्याग दें। DNase 1 उपचार के लिए, एक और अपकेंद्रित्र के लिए प्रत्येक कॉलम में आरएनए वॉश बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और RNase-मुक्त ट्यूबों में प्रति नमूना डीएनए पाचन बफर के डीएनए पाचन बफर के पांच माइक्रोलीटर मिलाएं।कमरे के तापमान पर 15 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए कॉलम मैट्रिस में सीधे मिश्रण जोड़ें, इसके बाद दो 400 माइक्रोलीटर आरएनए प्रीवॉश समाधान अपकेंद्रित्र द्वारा धोता है। आरएनए को स्पष्ट करने के लिए, अंतिम अपकेंद्रित्र के लिए प्रत्येक कॉलम मैट्रिक्स में सीधे DNase RNase-मुक्त पानी के 35 माइक्रोलीटर जोड़ें, और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर प्रत्येक नमूने की कुल आरएनए एकाग्रता और शुद्धता को मापें। इसके बाद आरएनए को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।छोटे आरएनएई के रेट्रोट्रांजेशन के लिए, प्रति सैंपल रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन मिक्स की एक ट्यूब में प्रीवॉश सॉल्यूशन के 10 माइक्रोलीटर में कुल आरएनए के 200 नैनोग्राम जोड़ें। मिश्रण के बाद, संक्षेप में नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और उन्हें बर्फ पर तब तक रखें जब तक कि उनकी इनक्यूबेशन न हो जाए। इसके बाद, ३७ डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, इसके बाद ९५ डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट की इनक्यूबेशन ।दूसरी इनक्यूबेशन के अंत में, 20 माइक्रोलीटर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया प्रति RNase-मुक्त पानी के 200 माइक्रोलीटर के साथ सीडीएनए को पतला करें, और प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण नमूने के 10 माइक्रोलीटर को एक प्रीलोडेड माउस भड़काऊ प्रतिक्रिया और ऑटोइयूमिट्यूटरी माइक्रोआरएनए पीसीआर सरणी के प्रत्येक कुएं में जोड़ें। प्रोस्ट्रस चरण को गोल आकार और अच्छी तरह से गठित नाभिकित एपिथेलियल कोशिकाओं की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है। जब माउस एस्ट्रस चरण में होता है, तो स्मगलर, कॉर्निफाइड और स्क्वैमस एपिथेलियल कोशिकाओं के घनी-पैक समूह धब्बा में देखे जाते हैं।मेटेस्ट्रस के दौरान, कॉर्निफाइड एपिथेलियल कोशिकाएं और बहुरूप न्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स देखे जाते हैं। मरने वालों में, ल्यूकोसाइट्स आम तौर पर अधिक प्रचलित होते हैं। आरएनए चार माउस फेफड़ों से निकाला, के रूप में प्रदर्शन, प्रदर्शन नाभिक एसिड सांद्रता ११९८ और २१७८ नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर और औसत A260 से A280 अनुपात के बीच २.०१ और २.०२ के बीच, और एक औसत A260 से A230 अनुपात के बीच २.१३९ और २.२२३ के बीच ।इस तालिका में, ओजोन और फ़िल्टर हवा उजागर चूहों के बीच माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति में दो गुना परिवर्तन लॉग इन दिखाया गया है। 14 माइक्रोआरएनए के लिए माइक्रोआरएनए लक्ष्य फ़िल्टर और कोर विश्लेषण के बाद, महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति लॉग अनुपात और पी मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, इन डेटा को माइक्रोआरएनए लक्ष्य फ़िल्टर द्वारा मैप किया जा सकता है। मुख्य विश्लेषण भी विहित रास्तों, रोगों और समारोह, नियामकों, और नेटवर्क के बारे में जानकारी प्रदान करता है ।इसके अलावा, कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग एक नेटवर्क विश्लेषण का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है जो ब्याज और अन्य अणुओं के माइक्रोआरएनए के बीच संबंध दिखाता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, प्रयोग करने से पहले कम से कम लगातार तीन चक्रों के लिए प्रतिदिन एस्ट्रोस चक्र की जांच करना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद, अन्य तरीकों को एस्ट्रोस चक्र में फेफड़ों के भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति के बारे में अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने फेफड़ों की प्रतिरक्षा के क्षेत्र में अन्य शोधकर्ताओं के लिए अन्य मॉडलों का उपयोग करके सेक्स हार्मोन विनियमन के तंत्र का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

प्रायोगिक Autoimmune Hypophysitis के SJL चूहे में प्रेरण

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

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से संक्रमित चूहों में बैक्टीरियल लोड और इम्यून प्रतिक्रियाएँ माप लिस्टेरिया monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

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कृत्रिम थूक मध्यम का प्रयोग खिलाफ टेस्ट एंटीबायोटिक प्रभावकारिता<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़े अधिक प्रासंगिक शर्तों में

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

फेफड़े और चूहों में प्रतिरक्षा ऊतकों के नमूनों की फसल के साथ सही Ventricular सिस्टोलिक युग्म में दबाव माप

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

चूहे में स्थानीय तीव्रग्राहिता मापने

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Embryonated चिकन अंडे में इन्फ्लुएंजा वायरस प्रचार

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Picornavirus 【tropism की MicroRNA आधारित विनियमन

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

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लीजोनेला pneumophila बाहरी झिल्ली Vesicles: अलगाव और मैक्रोफेज पर उनके समर्थक भड़काऊ संभावित का विश्लेषण

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

मानव परिशुद्धता में पदार्थों के साइटोटोक्सिक और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव का आकलन-कट फेफड़ों के स्लाइस

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

चूहों में मेजबान-रोगज़नक़ प्रतिक्रियाओं और वैक्सीन प्रभावकारिता का मूल्यांकन

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...