Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Gli autori ringraziano il Dr. Joanna Floros per l'assistenza con gli esperimenti di esposizione di ozono.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Penn State University.
1. valutazione della fase del ciclo estrale
<ol><li>Frenare correttamente una femmina mouse C57BL/6 (8 – 9 settimane) utilizzando la tecnica di ritenuta del mouse con una sola mano descritta in Machholz et al.10.</li>
	<li>Riempire la pipetta di plastica sterile con 10 μL di acqua ultra-pura.</li>
	<li>Introdurre la punta della pipett...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. 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E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. 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W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MicroRNA profiling è una tecnica vantaggiosa sia per la diagnosi delle malattie e ricerca meccanicistico. In questo manoscritto, abbiamo definito un protocollo per la valutazione dell'espressione dei miRNA che sono preveduti per regolare i geni infiammatori nei polmoni dei topi femminili esposti all'ozono nelle fasi differenti ciclo estrale. Metodi per la determinazione del ciclo estrale, ad esempio il metodo di rilevamento visivo, sono stati descritti16. Tuttavia, questi si basano su misure una ...

i microRNA (Mirna) sono brevi (19-25 nucleotidi), naturale, non-codificanti molecole di RNA. Sequenze di Mirna sono evolutivi conservata tra le specie, suggerendo l'importanza di miRNA nel regolare le funzioni fisiologiche1. Profilo di espressione di microRNA ha dimostrato di essere utile per l'identificazione di Mirna che sono importanti nella regolazione di vari processi, tra cui la risposta immunitaria, differenziamento cellulare, processi di sviluppo e apoptosi2. Più recentemente, Mirna sono stati riconosciuti per il loro uso potenziale nella malattia diagnostica e terapeutica. Per i ricercatori che studiano i meccanismi di regolazione genica, espressione dei miRNA di misurazione può illuminare sistemi-livello modelli di processi normativi, soprattutto quando le informazioni di miRNA sono unite con profilatura di mRNA e altri dati su scala genomica3. D'altra parte, i miRNA hanno anche dimostrati di essere più stabili di mRNA in una gamma di tipi di campioni e sono anche misurabili con sensibilità maggiore di proteine4. Questo ha portato alla notevole interesse nello sviluppo di Mirna come biomarcatori per diverse applicazioni di diagnostiche molecolare, tra cui malattie polmonari.
Nel polmone, miRNA svolgono un ruolo importante nei processi di sviluppo e il mantenimento dell'omeostasi. Inoltre, la loro espressione anormale è stato associato con lo sviluppo e la progressione di varie malattie polmonari5. Malattia infiammatoria polmonare indotta dall'inquinamento atmosferico ha dimostrato una maggiore gravità e prognosi nelle femmine, che indica che gli ormoni e il ciclo estrale può regolare del polmone innata immunità e miRNA espressione in risposta alle sfide ambientali 6. nel presente protocollo, usiamo l'esposizione dell'ozono, che è una componente importante di inquinamento atmosferico, per indurre una forma di infiammazione polmonare in topi femminili che si verifica in assenza di immunità adattativa. Utilizzando ozono, noi stiamo inducendo lo sviluppo di hyperresponsiveness della via aerea che è associato con danno delle cellule epiteliali delle vie aeree e un aumento in neutrofili e mediatori infiammatori nelle vie aeree prossimali7. Attualmente, non esistono protocolli ben descritti a caratterizzare e analizzare Mirna attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono.
Di seguito, descriviamo un metodo semplice per identificare le fasi del ciclo estrale ed espressione dei miRNA nel tessuto polmonare dei topi femminili esposti all'ozono. Ci rivolgiamo anche bioinformatica efficaci approcci all'identificazione di scoperta e di destinazione di miRNA, con un'enfasi su biologia computazionale. Analizziamo i dati di microarray utilizzando limma, un software R/Bioconductor che fornisce una soluzione integrata per l'analisi dei dati di espressione genica esperimenti8. Analisi dei dati di matrice PCR da limma ha un vantaggio in termini di potenza sul t-test basato procedure quando si utilizza il piccolo numero di matrici/campioni per confrontare l'espressione. Per comprendere il contesto biologico di risultati di espressione di miRNA, abbiamo poi utilizzato il software di analisi funzionale. Al fine di comprendere i meccanismi di regolazione trascrizionale modifiche e a prevedere i risultati probabili, il software combina i set di dati di espressione dei miRNA e conoscenza dalla letteratura9. Questo è un vantaggio se confrontato con software che basta guardare per statistica arricchimento in sovrapposizione a insiemi di Mirna.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

Profilatura di MicroRNA (miRNA) è diventato di interesse per i ricercatori che lavorano in diverse aree di ricerca della biologia e della medicina. Gli studi correnti indicano un promettente futuro di utilizzando miRNA nella diagnosi e cura di malattie polmonari. Qui, viene definito un protocollo per i miRNA profilatura per misurare l'abbondanza relativa di un gruppo di Mirna preveduti che regolano i geni infiammatori nel tessuto polmonare da di un modello di topo di infiammazione delle vie aeree indotta da ozono. Perché è stato dimostrato che livelli di ormoni sessuali circolanti possono influire sulla regolazione dell'immunità innata del polmone nelle femmine, lo scopo di questo metodo è di descrivere un miRNA infiammatoria profilatura protocollo nei topi femmina, prendendo in considerazione il ciclo estrale fase di ogni animale al momento dell'esposizione all'ozono. Ci rivolgiamo anche approcci di bioinformatica applicabile a miRNA discovery e destinazione metodi di identificazione tramite limma, un software R/Bioconductor, e software di analisi funzionale per capire il contesto biologico e percorsi associati con espressione differenziale dei miRNA.

I tipi differenti delle cellule osservati negli strisci vengono utilizzati per identificare la fase del ciclo estrale del mouse (Figura 1). Questi sono identificati dalla morfologia delle cellule. Durante il proestro, le cellule sono quasi esclusivamente gruppi di cellule epiteliali nucleate forma circolare, ben formate (Figura 1A). Quando il mouse è in fase di estro, le cellule sono cellule epiteliali squamous cornified, presen...

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Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

Qui descriviamo un metodo per valutare l'espressione di polmone di Mirna che sono preveduti per regolare i geni infiammatori utilizzando topi esposti all'ozono o aria filtrata nelle diverse fasi del ciclo estrale.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunità polmonare su come valutare l'espressione dei microRNA che si prevede regolino i geni infiammatori all'interno del polmone. Questa tecnica offre il modo semplice per identificare i contributi degli ormoni circolanti all'espressione del microRNA polmonare. Per valutare la fase del ciclo estrosa, trattenere manualmente un topo femmina di otto-nove settimane e introdurre la punta di una pipetta di plastica da 10 microliter riempita con acqua ultra pura nella vagina.Sciacquare delicatamente da quattro a cinque volte per raccogliere un campione e depositare lo scarico finale di liquido vaginale su uno scivolo di vetro. Quindi osservare il lavaggio vaginale non macchiato sotto un microscopio leggero con ingrandimento 20X. Per le esposizioni all'ozono e all'aria filtrata, posizionare un massimo di quattro topi in uno dei due singoli contenitori di vetro da 1,2 litri con coperchi in rete metallica.Mettere un contenitore di vetro in una camera di ozono e uno in una camera di esposizione all'aria filtrata. Quindi regolare la concentrazione di ozono a due parti per milione, rimuovendo il contenitore dopo tre ore. Quattro ore dopo l'esposizione, disinfettare la superficie cutanea esposta del primo topo sperimentale con il 70% di etanolo e tagliare la gabbia toracica per esporre il cuore e i polmoni.Utilizzare le forcep per immergere un tubo di micro centrifuga privo di RNasi da 1,5 millilitri nell'azoto liquido e congelare il polmone raccolto nell'azoto liquido. Quindi utilizzare un polverizzatore di tessuto in acciaio inossidabile per mascerare l'intero polmone e dividere il tessuto polverizzato tra due tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Dopo aver raccolto e polverizzato i polmoni da tutti gli animali allo stesso modo, aggiungere 500 microlitri di tiocianato di guanidinio a ciascun campione e omogeneizzare sequenzialmente ogni tessuto con aghi calibro 18, 21 e 23.Dopo l'ultima omogeneizzazione, aggiungere 500 microlitri di etanolo a ciascun campione prima del vortice per 15 secondi. Caricare le miscele in singole colonne di spin in singoli tubi di raccolta per la centrifugazione e scartare i flowthrough. Per il trattamento con DNasi 1, aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio dell'RNA a ciascuna colonna per un'altra centrifugazione e mescolare cinque microlitri di DNasi 1 e 75 microlitri di tampone di digestione del DNA per campione in tubi senza RNasi.Aggiungere la miscela direttamente alle matrici di colonna per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, seguita da due lavaggi di soluzione di prelavaggio dell'RNA da 400 microliter mediante centrifugazione. Per elutare l'RNA, aggiungere 35 microlitri di acqua priva di DNA direttamente a ciascuna matrice di colonna per una centrifugazione finale e misurare la concentrazione totale di RNA e la purezza di ogni campione su uno spettrofotometro. Quindi conservare l'RNA a meno 80 gradi Celsius.Per la retrotrascrizione della piccola RNasi, aggiungere 200 nanogrammi di RNA totale in 10 microlitri di soluzione di prelavaggio a un tubo di miscela di reazione di trascrizione inversa per campione. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente i campioni e metterli sul ghiaccio fino alla loro incubazione. Successivamente, incubare i tubi per 60 minuti a 37 gradi Celsius, seguiti da un'incubazione di cinque minuti a 95 gradi Celsius.Alla fine della seconda incubazione, diluire il CDNA con 200 microlitri di acqua priva di RNasi per reazione di trascrizione inversa di 20 microlitri e aggiungere 10 microlitri di ogni campione di miscela di reazione ad ogni pozzo di una risposta infiammatoria del mouse precaricata e di un array PCR di microRNA autoimmuni. Lo stadio del proestro può essere identificato dalla presenza di cellule epiteliali nucleate a forma rotonda e ben formate. Quando il topo si trova nella fase dell'estro, nello striscio si osservano grappoli densamente impacchettati di cellule epiteliali anucleate, cornificate e squamose.Durante il metestro, si vedono cellule epiteliali cornificate e leucociti polimorfonucleari. Nel diestro, i leucociti sono generalmente più diffusi. L'RNA estratto da quattro polmoni a topo, come dimostrato, mostra concentrazioni di acido nucleico che vanno da 1198 a 2178 nanogrammi per microlitro e un rapporto medio da A260 a A280 tra 2,01 e 2,02 e un rapporto medio da A260 a A230 tra 2,139 e 2,223.In questa tabella, vengono mostrati cambiamenti due volte nell'espressione del microRNA tra ozono e topi esposti all'aria filtrata. Dopo il filtro di destinazione del microRNA e l'analisi del nucleo per 14 microRNA, per ottenere il significativo rapporto di registro delle espressioni e i valori P, questi dati possono essere mappati dal filtro di destinazione del microRNA. L'analisi di base fornisce anche informazioni su percorsi canonici, malattie e funzioni, regolatori e reti.Inoltre, il software di analisi funzionale può essere utilizzato per produrre un'analisi di rete che mostra la relazione tra i microRNA di interesse e altre molecole. Durante il tentativo di questa procedura, è importante controllare il ciclo dell'estro ogni giorno per almeno tre cicli consecutivi prima di condurre un esperimento. Seguendo questa procedura, altri metodi possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sull'espressione genica infiammatoria polmonare durante il ciclo dell'estro.Dopo lo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ad altri ricercatori nel campo dell'immunità polmonare per esplorare meccanismi di regolazione dell'ormone sessuale utilizzando altri modelli.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

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