Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra NIH K01HL133520 (PS) og K12HD055882 (PS). Forfatterne takker Dr. Joanna Floros for hjelp med ozon eksponering eksperimenter.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Penn State University.
1. vurdering av Estrous syklus scenen
<ol><li>Skal holde en kvinnelig C57BL/6 mus (8 – 9 uker gamle) bruker én hånd musen tilbakeholdenhet teknikken beskrevet i Machholz et al.10.</li>
	<li>Fyll den sterile plastikk pipe med 10 μL ultra rent vann.</li>
	<li>Innføre spissen av plastikk pipe i skjeden.</li>
	<li>Forsiktig flush væsken...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MicroRNA profilering er en fordelaktig teknikk for både sykdom diagnose og mekanistisk forskning. I dette manuskriptet definert vi en protokoll for å evaluere uttrykk for miRNAs som er spådd for å regulere inflammatorisk gener i lungene av kvinnelige mus utsatt for ozon i forskjellige estrous syklus faser. Metoder for fastsettelse av estrous syklusen, som visuelle oppdagelse metode, har vært beskrevet16. Men disse avhengige engangs målinger, og derfor er upålitelige. For å nøyaktig identi...

microRNAs (miRNAs) er kort (19 til 25 nukleotider), naturlig forekommende, ikke-koding RNA molekyler. Sekvenser av miRNAs er evolusjonære bevart over arter, tyder betydningen av miRNAs i å regulere fysiologiske funksjoner1. microRNA expression profilering har vist seg for å være nyttig for å identifisere miRNAs som er viktige i regulering av en rekke prosesser, inkludert immunforsvar, celledifferensiering, utviklingsprosesser og apoptose2. Nyligere har miRNAs blitt anerkjent for deres mulige bruk i sykdom diagnostikk og therapeutics. For forskere studere mekanismer av genet, kan måle miRNA uttrykk opplyse systemer nivå modeller av regulatoriske prosesser, spesielt når miRNA informasjonen flettes med mRNA profilering og andre genomet-skalaen data3. På den annen side, miRNAs har også vist seg å være mer stabilt enn mRNAs i en rekke prøven typer og er også målbar med større følsomhet enn proteiner4. Dette har ført til betydelig interesse for utvikling av miRNAs som biomarkers for ulike molekylær diagnostiske programmer, inkludert lungesykdommer.
I lungene spille miRNAs viktige roller i utviklingsprosesser og vedlikehold av homeostase. Videre har deres unormale uttrykk vært knyttet til utvikling og progresjon av ulike lungesykdommer5. Inflammatorisk lungesykdommer forårsaket av luftforurensning har vist større alvorlighetsgrad og dårligere prognose i kvinner, som indikerer at hormoner og estrous syklusen kan regulere lunge medfødt immunitet og miRNA uttrykk i reaksjoner på miljørelaterte utfordringer 6. i denne protokollen, bruker vi ozon eksponering, som er en viktig komponent av luftforurensning, for å indusere en form for lungebetennelse i kvinnelige mus som oppstår i fravær av adaptiv immunitet. Ved hjelp av ozon, er vi indusere utviklingen av luftveiene hyperresponsiveness som er tilknyttet airway epithelial celleskader og en økning i nøytrofile og inflammatoriske mediatorer i proksimale airways7. Foreløpig er det ikke godt beskrevet protokoller for å karakterisere og analysere miRNAs over estrous syklusen i ozon-eksponerte mus.
Nedenfor beskriver vi en enkel metode for å identifisere estrous syklus faser og miRNA uttrykk i lungevev av kvinnelige mus utsatt for ozon. Vi også ta effektive bioinformatikk tilnærminger til miRNA oppdagelsen og target identifikasjon, med vekt på beregningsorientert biologi. Vi analyserer microarray dataene med limma, en R/Bioconductor programvare som tilbyr en integrert løsning for å analysere data gen uttrykk eksperimenter8. Analyse av PCR matrisedata fra limma har en fordel i forhold til makt over t-test basert prosedyrer når bruk av matriser/prøver for å sammenligne uttrykk. For å forstå biologisk sammenheng med miRNA uttrykk resultater, brukt vi så funksjonell analyseprogramvare. For å forstå mekanismene regulere transcriptional endringer og forutse sannsynlig utfall, kombinerer programvaren miRNA uttrykk datasett og kunnskap fra litteratur9. Dette er en fordel når sammenlignet med programvare som bare se for statistiske berikelse i overlappende til sett med miRNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

MicroRNA (miRNA) profilering blitt interesse forskerne arbeider i ulike forskningsområder av biologi og medisin. Aktuelle studier viser en lovende fremtid for å bruke miRNAs i diagnostikk og av lungesykdommer. Her definerer vi en protokoll for miRNA profilering for å måle den relative overfloden av en gruppe miRNAs spådd for å regulere inflammatorisk gener i lungevev fra et ozon-indusert airway betennelse mus modell. Fordi det har vist at sirkulerende sex hormonnivået kan påvirke regulering av lunge medfødt immunitet hos kvinner, er formålet med denne metoden å beskrive en inflammatorisk miRNA profilering protokollen i kvinnelige mus, hensyntatt estrous syklusen scenen av hvert dyr samtidig med ozon eksponering. Vi også ta gjeldende bioinformatikk tilnærminger til miRNA oppdagelse og målet identifikasjonsmetoder benytter limma, en R/Bioconductor programvare, og funksjonell analyseprogramvare å forstå biologisk sammenheng og veier knyttet differensial miRNA uttrykk.

De ulike celletyper i utstryk brukes til å identifisere musen estrous syklus scenen (figur 1). Disse identifiseres av celle morfologi. Under proestrus er cellene nesten utelukkende klynger av rund-formet, velformet kjerne epitelceller (figur 1A). Når musen er estrus, er cellene cornified plateepitel epitelceller, finnes i tettpakkede klynger (figur 1B). Under metestrus, cornified epitelceller og po...

Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Lunge microRNA profilering over the Estrous syklus i ozon-eksponerte mus

Her vi beskriver en metode for å vurdere lunge uttrykk av miRNAs som er spådd for å regulere inflammatorisk gener bruker mus utsatt for ozon eller filtrert luft på ulike stadier av estrous syklusen.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i lungeimmunitetsfeltet om hvordan man vurderer uttrykket av microRNAs som er spådd å regulere inflammatoriske gener i lungene. Denne teknikken tilbyr den enkle måten å identifisere bidragene fra sirkulerende hormoner til lungemikroRNA-uttrykk. For å vurdere estrous syklus scenen, manuelt begrense en åtte til ni uker gammel kvinnelig mus og introdusere spissen av en plast 10-mikroliter pipette fylt med ultra rent vann inn i skjeden.Skyll forsiktig fire til fem ganger for å samle en prøve, og deponer den endelige spylingen av vaginal væske på et glasssklie. Deretter observere den ødede vaginal flush under et lett mikroskop ved 20X forstørrelse. For ozon- og filtrerte lufteksponeringer plasserer du maksimalt fire mus i en av to individuelle 1,2 liters glassbeholdere med nettinglokk.Sett en glassbeholder i et ozonkammer og en i et filtrert lufteksponeringskammer. Juster deretter ozonkonsentrasjonen til to deler per million, og fjern beholderen etter tre timer. Fire timer etter eksponering desinfiserer du den eksponerte hudoverflaten til den første eksperimentelle musen med 70 % etanol og skjærer bort brystkassen for å eksponere hjertet og lungene.Bruk tang til å senke en 1,5 milliliter RNase-fri mikro sentrifuge rør i flytende nitrogen, og snap fryse høstet lunge i flytende nitrogen. Bruk deretter en rustfritt stål vev pulverizer å mascerate hele lungene, og dele pulverisert vev mellom to 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør. Etter høsting og pulverisering lungene fra alle dyrene på samme måte, tilsett 500 mikroliter guanidinium tiocyanat til hver prøve og sekvensielt homogenisere hvert vev med 18, 21 og 23 gauge nåler.Etter den siste homogeniseringen, legg til 500 mikroliter etanol til hver prøve før vortexing i 15 sekunder. Last blandingene inn i individuelle spinnsøyler i individuelle oppsamlingsrør for sentrifugering og kast gjennomstrømningene. For DNase 1-behandling, tilsett 400 mikroliter RNA-vaskebuffer til hver kolonne for en annen sentrifugasjon og bland fem mikroliter DNase 1 og 75 mikroliter DNA-fordøyelsesbuffer per prøve i RNase-frie rør.Tilsett blandingen direkte til søylematrisene for en 15-minutters inkubasjon ved romtemperatur, etterfulgt av to 400 mikroliter RNA forvaskløsning vasker ved sentrifugering. For å elute RNA, tilsett 35 mikroliter DNase RNase-fritt vann direkte til hver kolonnematrise for en endelig sentrifugasjon, og mål den totale RNA-konsentrasjonen og renheten til hver prøve på et spektrofotometer. Deretter lagrer du RNA på minus 80 grader Celsius.For retrotranscription av små RNase, tilsett 200 nanogram totalt RNA i 10 mikroliter forvaskløsning til ett rør med omvendt transkripsjonsreaksjonsblanding per prøve. Etter blanding sentrifuger du prøvene kort og legger dem på is til inkubasjonen. Deretter inkubere rørene i 60 minutter ved 37 grader Celsius, etterfulgt av en fem minutters inkubasjon ved 95 grader Celsius.På slutten av den andre inkubasjonen fortynner du CDNA med 200 mikroliter RNase-fritt vann per 20 mikroliter omvendt transkripsjonsreaksjon, og tilsett 10 mikroliter av hver reaksjonsblandingsprøve til hver brønn av en forhåndslastet musinflammatorisk respons og autoimmunitet microRNA PCR array. Fremspringstadiet kan identifiseres ved tilstedeværelse av runde formede og velformede kjernedepitelceller. Når musen er i estrusstadiet, observeres tettpakkede klynger av anucleated, cornified og plateepitelceller i smøringen.Under metestrus ses cornified epitelceller og polymorfotonukle leukocytter. I diestrus er leukocytter generelt mer utbredt. RNA ekstrahert fra fire muselunger, som demonstrert, viser nukleinsyrekonsentrasjoner mellom 1198 og 2178 nanogram per mikroliter og gjennomsnittlig A260 til A280-forhold mellom 2,01 og 2,02, og et gjennomsnittlig A260 til A230-forhold mellom 2,139 og 2,223.I denne tabellen vises todoble endringer i microRNA-uttrykk mellom ozon og filtrerte luft eksponerte mus. Etter microRNA-målfilter og kjerneanalyse for 14 microRNAer, for å oppnå det betydelige uttrykksloggforholdet og P-verdiene, kan disse dataene tilordnes av microRNA-målfilteret. Kjerneanalysen gir også informasjon om kanoniske veier, sykdommer og funksjon, regulatorer og nettverk.Videre kan den funksjonelle analyseprogramvaren brukes til å produsere en nettverksanalyse som viser forholdet mellom mikroRNA-ene av interesse og andre molekyler. Mens du prøver denne prosedyren, Det er viktig å sjekke estrus syklus daglig i minst tre påfølgende sykluser før du gjennomfører et eksperiment. Etter denne prosedyren kan andre metoder utføres for å svare på flere spørsmål om lungeinflammatorisk genuttrykk over estrussyklusen.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for andre forskere innen lungeimmunitet for å utforske mekanismer for kjønnshormonregulering ved hjelp av andre modeller.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Høyre systoletrykk Mål i kombinasjon med Harvest of Lung og Immune vevsprøver i Mus

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Måle Lokale anafylaksi i Mus

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa virus Formering i embryon Chicken Egg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

MikroRNA-baserte Regulering av picornavirus tropisme

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ytre membran Blemmer: Isolering og analyse av deres Pro-inflammatorisk potensialet på Makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Vurdering av den cytotoksiske og immunmodulerende effekter av stoffer i menneskelig presisjonsstyrte kutte lunge skiver

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering av Host-patogen svar og vaksinen i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...