Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por concessões do NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Os autores Dr. Joanna Floros agradecer a assistência com experimentos de exposição de ozônio.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Penn State University.
1. avaliação do estágio do ciclo estral
<ol><li>Corretamente, conter uma fêmea C57BL/6 mouse (8 – 9 semanas de idade) usando a técnica de contenção de rato com uma mão descrita em Machholz et al10.</li>
	<li>Encha a pipeta plástica estéril com 10 μL de água ultra pura.</li>
	<li>Introduza a ponta da pipeta pl...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. 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W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MicroRNA perfis é uma técnica vantajosa para diagnóstico da doença e investigação mecanicista. Neste manuscrito, definimos um protocolo para avaliar a expressão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios nos pulmões de ratos fêmeas expostos ao ozônio nas fases do ciclo estral diferente. Métodos para a determinação do ciclo estral, tais como o método de detecção visual, têm sido descritos16. No entanto, estes dependem de medições one-time e, portanto, não ...

microRNAs (miRNAs) são curtos (19-25 nucleotides), ocorrem naturalmente, não-codificantes moléculas de RNA. Sequências de miRNAs são evolutivas conservada entre espécies, sugerindo a importância de miRNAs na regulação de funções fisiológicas1. microRNA expression profiling tem provado para ser útil para identificar os miRNAs que são importantes na regulação de uma variedade de processos, incluindo a resposta imune, diferenciação celular, processos de desenvolvimento e apoptose2. Mais recentemente, os miRNAs foram reconhecidos por seu potencial uso no diagnóstico da doença e terapêutica. Para pesquisadores estudando os mecanismos de regulação gênica, medir miRNA expressão pode iluminar sistemas-nível modelos de processos regulatórios, especialmente quando informações miRNA são mescladas com mRNA profiling e outros dados de genoma-escala3. Por outro lado, os miRNAs também foram mostrados para ser mais estável que os mRNAs em uma variedade de tipos de amostra e também são mensuráveis com maior sensibilidade do que proteínas4. Isto levou a interesse considerável no desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores para diversas aplicações de diagnósticos moleculares, incluindo doenças pulmonares.
No pulmão, miRNAs desempenham um papel importante nos processos de desenvolvimento e a manutenção da homeostase. Além disso, sua expressão anormal tem sido associada com o desenvolvimento e a progressão de várias doenças pulmonares5. Doença pulmonar inflamatória induzida pela poluição do ar tem demonstrado maior gravidade e pior prognóstico nas fêmeas, indicando que os hormônios e o ciclo estral podem regular pulmão inata imunidade e miRNA expressão em resposta aos desafios ambientais 6. no presente protocolo, usamos a exposição de ozônio, que é um componente importante da poluição do ar, para induzir uma forma de inflamação pulmonar em ratos fêmeas que ocorre na ausência de imunidade adaptativa. Usando ozônio, nós estão induzindo o desenvolvimento das vias aéreas hyperresponsiveness que está associada a danos nas células epiteliais das vias respiratórias e um aumento de neutrófilos e mediadores inflamatórios em vias aéreas proximais7. Atualmente, não existem protocolos bem descritos para caracterizar e analisar os miRNAs em todo o ciclo estral em camundongos expostos de ozônio.
Abaixo, descrevemos um método simples para identificar os estágios do ciclo estral e miRNA expressão no tecido pulmonar de ratos fêmeas exposto ao ozônio. Também abordamos a bioinformática eficazes abordagens para identificação miRNA descoberta e alvo, com ênfase na biologia computacional. Analisamos os dados de microarray usando- se, um software de R/Bioconductor que fornece uma solução integrada para a análise de dados a partir de experimentos de expressão de gene8. Análise de dados de matriz PCR de se tem uma vantagem em termos de poder sobre os procedimentos de teste-t com base quando usando o pequeno número de amostras/matrizes para comparar a expressão. Para compreender o contexto biológico miRNA dos resultados da expressão, usamos o software de análise funcional. Para entender os mecanismos de regulação transcricionais mudanças e prever os prováveis resultados, o software combina miRNA-expressão datasets e conhecimento a partir da literatura9. Esta é uma vantagem quando comparado com o software que só olham para o enriquecimento estatístico em sobreposição a conjuntos de miRNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

Criação de perfil de MicroRNA (miRNA) tornou-se de interesse para os investigadores que trabalham em diversas áreas de pesquisa da biologia e da medicina. Atuais estudos mostram um promissor futuro de usar miRNAs no diagnóstico e cuidados de doenças pulmonares. Aqui, definimos um protocolo para miRNA perfis para medir a abundância relativa de um grupo de miRNAs previstos para regular os genes inflamatórios no tecido do pulmão de um modelo de mouse de inflamação das vias aéreas induzida por ozônio. Porque tem sido demonstrado que os níveis de hormônio sexual circulante podem afetar a regulação da imunidade inata de pulmão em mulheres, a finalidade desse método é descrever um inflamatório miRNA perfilação protocolo em ratos fêmeas, levando em consideração o ciclo estral estágio de cada animal no momento da exposição do ozônio. Abordamos também abordagens aplicáveis bioinformática com miRNA uma métodos de identificação de descoberta e de destino usando- se, um software R/Bioconductor, e software de análise funcional de entender o contexto biológico e caminhos associados expressão diferencial de miRNA.

Os diferentes tipos de células observados em esfregaços são usados para identificar o estágio do ciclo estral de rato (Figura 1). Estes são identificados pela morfologia celular. Durante o proestro, as células são quase exclusivamente de aglomerados de células epiteliais nucleadas redondas, bem formados (figura 1A). Quando o mouse está na fase de estro, as células são células epiteliais escamosas cornificadas, present...

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Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Pulmão microRNA Profiling através do ciclo estral em camundongos expostos de ozônio

Aqui nós descrevemos um método para avaliar a expressão de pulmão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios usar ratos expostos ao ozônio ou ar filtrado em diferentes fases do ciclo estral.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da imunidade pulmonar sobre como avaliar a expressão de microRNAs que são previstas para regular genes inflamatórios dentro do pulmão. Esta técnica oferece a maneira simples de identificar as contribuições dos hormônios circulantes para a expressão de microRNA pulmonar. Para avaliar o estágio de ciclo estrous, contenha manualmente um rato fêmea de oito a nove semanas de idade e introduza a ponta de uma pipeta de plástico de 10 microliter preenchida com água ultra pura na vagina.Lave suavemente de quatro a cinco vezes para coletar uma amostra, e deposite a descarga final de fluido vaginal em um slide de vidro. Em seguida, observe a descarga vaginal não manchada sob um microscópio leve na ampliação de 20X. Para exposições de ozônio e ar filtrado, coloque no máximo quatro ratos em um dos dois recipientes individuais de vidro de 1,2 litros com tampas de malha de arame.Coloque um recipiente de vidro em uma câmara de ozônio e outro em uma câmara de exposição ao ar filtrada. Em seguida, ajuste a concentração de ozônio para duas partes por milhão, removendo o recipiente após três horas. Quatro horas após a exposição, desinfetar a superfície exposta da pele do primeiro rato experimental com 70% de etanol e cortar a caixa torácica para expor o coração e os pulmões.Use fórceps para submergir um tubo de micro centrífuga sem RNase de 1,5 mililitro no nitrogênio líquido, e congelar o pulmão colhido no nitrogênio líquido. Em seguida, use um pulverizador de tecido de aço inoxidável para mastigar todo o pulmão, e divida o tecido pulverizado entre dois tubos de microcentrífa de 1,5 mililitro. Após a colheita e pulverização dos pulmões de todos os animais desta mesma maneira, adicione 500 microliters de tiocianato de guanidinium a cada amostra e homogeneize sequencialmente cada tecido com agulhas de 18, 21 e 23.Após a última homogeneização, adicione 500 microliters de etanol a cada amostra antes do vórtice por 15 segundos. Carregue as misturas em colunas de giro individuais em tubos de coleta individuais para centrifugação e descarte os fluxos. Para o tratamento DNase 1, adicione 400 microliters de tampão de lavagem de RNA a cada coluna para outra centrifugação e misture cinco microlitadores de DNase 1 e 75 microliters de tampão de digestão de DNA por amostra em tubos livres de RNase.Adicione a mistura diretamente às matrizes da coluna para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, seguida por duas soluções de pré-lavagem de RNA de 400 microliter lavadas por centrifugação. Para elutar o RNA, adicione 35 microliters de água livre de DNase RNase diretamente a cada matriz de coluna para uma centrifugação final, e meça a concentração total de RNA e pureza de cada amostra em um espectotógrafo. Em seguida, armazene o RNA a menos 80 graus Celsius.Para retrotrancrição de RNase pequena, adicione 200 nanogramas de RNA total em 10 microliters de solução pré-lavagem a um tubo de mistura de reação de transcrição reversa por amostra. Após a mistura, centrifufique brevemente as amostras e coloque-as no gelo até sua incubação. Em seguida, incubar os tubos por 60 minutos a 37 graus Celsius, seguido por uma incubação de cinco minutos a 95 graus Celsius.No final da segunda incubação, diluir a CDNA com 200 microliters de água livre de RNase por reação de transcrição reversa de 20 microliteres, e adicionar 10 microliters de cada amostra de mix de reação a cada poço de uma resposta inflamatória pré-carregada do rato e matriz microRNA PCR de autoimunidade. O estágio proestrus pode ser identificado pela presença de células epiteliais nucleadas em forma redonda e bem formadas. Quando o camundongo está no estágio estrus, aglomerados densamente embalados de células epiteliais anucleadas, cornificadas e escamosas são observadas na mancha.Durante o metestrus, são vistas células epiteliais cornificadas e leucócitos polimorfonucleares. Em diestrus, leucócitos são geralmente mais prevalentes. O RNA extraído de quatro pulmões de camundongos, como demonstrado, exibe concentrações de ácido nucleico variando entre 1198 e 2178 nanogramas por microliter e proporção média de A260 a A280 entre 2,01 e 2,02, e uma razão média de A260 a A230 entre 2,139 e 2,223.Nesta tabela, registram duas vezes as alterações na expressão de microRNA entre o ozônio e ratos expostos ao ar filtrado são mostrados. Após o filtro de destino microRNA e a análise do núcleo para 14 microRNAs, para obter a significativa relação de registro de expressão e valores P, esses dados podem ser mapeados pelo filtro de destino microRNA. A análise central também fornece informações sobre caminhos canônicos, doenças e função, reguladores e redes.Além disso, o software de análise funcional pode ser usado para produzir uma análise de rede que mostre a relação entre as microRNAs de interesse e outras moléculas. Ao tentar este procedimento, é importante verificar o ciclo de estrus diariamente por pelo menos três ciclos consecutivos antes de realizar um experimento. Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão genética inflamatória pulmonar em todo o ciclo de estrus.Após o desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que outros pesquisadores do campo da imunidade pulmonar explorassem mecanismos de regulação do hormônio sexual usando outros modelos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Imunologia e Infecção

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Sistólica do ventrículo direito Medição de Pressão em combinação com colheita de amostras de tecido pulmonar e imunológica em ratos

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Regulamento baseada MicroRNA de Picornavirus tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...