Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантов из низ K01HL133520 (PS) и K12HD055882 (PS). Авторы благодарят д-р Джоанна Floros за помощь с озоном воздействия экспериментов.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Пенсильвания.
1. Оценка стадии эстрального цикла
<ol><li>Должным образом сдерживать C57BL/6 мышь (8-9 недель) с помощью Одноручные мыши сдержанность мет?...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

МикроРНК профилирование является выгодным техника для диагностики заболеваний и механистические исследований. В этой рукописи мы определили протокол для оценки выражения интерферирующим прогнозам регулировать воспалительные гены в легких самок мышей, воздействию озона в различных...

микроРНК (интерферирующим) являются короткие (19-25 нуклеотидов), естественным, некодирующих молекул РНК. Последовательности адаптивной эволюционных сохранение видов, предлагая важность интерферирующим в регулировании физиологические функции1. микроРНК выражение профилирование было доказано быть полезны для выявления адаптивной, которые имеют важное значение в регуляции различных процессов, в том числе иммунного ответа, дифференцировки клеток, процессов развития и апоптоз2. Совсем недавно адаптивной были признаны за их потенциального использования в терапии и диагностики заболеваний. Для исследователей, изучение механизмов регуляции генов измерения Мирна выражение может просветить модели уровне систем регулирования процессов, особенно когда Мирна информации объединяется с мРНК профилирования и другие геном масштаба данных3. С другой стороны адаптивной также было показано, быть более стабильным, чем mRNAs в широкий спектр типов образцов и также поддаются измерению с большей чувствительностью, чем белки4. Это привело к большой интерес в развитии интерферирующим качестве биомаркеров для различных молекулярных диагностических приложений, включая легочных заболеваний.
В легких адаптивной играют важную роль в процессах развития и поддержания гомеостаза. Кроме того их аномальные выражения был связан с развития и прогрессирования различных легочных заболеваний5. Воспалительные легочных заболеваний, вызванных загрязнением воздуха продемонстрировала большую серьезность и бедных прогнозом у самок, указав, что гормоны и эстральный цикл может регулировать легких врожденный иммунитет и Мирна выражение в ответ на экологические проблемы 6. в настоящем Протоколе, мы используем воздействия озона, который является одним из основных компонентов загрязнения воздуха, чтобы побудить форму воспаления легких в самок мышей, что происходит в отсутствие адаптивного иммунитета. С помощью озона, мы вызывая развитие сократимость hyperresponsiveness, который связан с повреждения эпителиальных клеток дыхательных путей и увеличение числа нейтрофилов и воспалительных медиаторов в проксимальном airways7. В настоящее время есть не хорошо описанные протоколы охарактеризовать и проанализировать интерферирующим эстрального цикла в подвергшихся воздействию озона мышей.
Ниже мы опишем простой метод для определения этапов эстрального цикла и Мирна выражение в легочной ткани самок мышей, воздействию озона. Мы также рассмотреть эффективные биоинформатики подходы к обнаружения и целевой идентификации Мирна, с акцентом на вычислительной биологии. Мы анализируем microarray данные с помощью Лимма, R/Bioconductor программное обеспечение, которое обеспечивает интегрированное решение для анализа данных из выражения гена эксперименты8. Анализ ПЦР массива данных от Лимма имеет преимущество с точки зрения власти над t теста на основе процедур при использовании небольшое количество массивов/образцы для сравнения выражений. Чтобы понять биологические контексте Мирна выражение результатов, затем мы использовали программное обеспечение функционального анализа. Для того чтобы понять механизмы, регулирующие transcriptional изменений и прогнозирования вероятных результатов, программное обеспечение сочетает в себе Мирна выражения наборов данных и знаний из литературы9. Это преимущество по сравнению с программным обеспечением, просто искать статистических обогащения в перекрывающимися наборами адаптивной.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

МикроРНК (miRNA) профилирование стал интерес для исследователей, работающих в различных областях исследований в биологии и медицины. Текущие исследования показывают, многообещающего будущего использования адаптивной диагностики и ухода за легочных заболеваний. Здесь мы определить протокол для Мирна, профилирование для измерения относительного изобилия группы интерферирующим предсказал регулировать воспалительные гены в легочной ткани от модели мыши воспаление озона индуцированной дыхательных путей. Потому что было показано, что циркулирующие уровни полового гормона может повлиять на регулирование легких врожденного иммунитета у самок, этот метод предназначен для описания воспалительных Мирна, профилирование протокол в самок мышей, принимая во внимание эстральный цикл стадии каждого животного во время воздействия озона. Мы также рассмотреть применимые биоинформатики подходы к Мирна обнаружения и целевых методов идентификации с помощью Лимма, R/Bioconductor программного обеспечения, и программное обеспечение функционального анализа для понимания биологических контекст и пути, связанные с Дифференциальный Мирна выражение.

Различных типов клеток в мазках используются для идентификации этапа эстрального цикла мыши (рис. 1). Они идентифицируются по морфологии клеток. Во время proestrus клетки являются почти исключительно кластеры-округлой формы, сформирован ядерных эпителиаль...

Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

МикроРНК легких профилирования через эстральный цикл в подвергшихся воздействию озона мышей

Здесь мы описываем метод, чтобы оценить выражение легких адаптивной, прогнозируются регулировать воспалительные гены с помощью мыши воздействию озона или отфильтрованным воздухом на разных стадиях эстрального цикла.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области легких иммунитета о том, как оценить экспрессию микроРНК, которые, по прогнозам, регулируют воспалительные гены в легких. Этот метод предлагает простой способ определения вклада циркулирующих гормонов в экспрессию микроРНК легких. Чтобы оценить этап цикла эструса, вручную сдерживайте восьми-девятинедельную самку мыши и ввемите кончик пластиковой 10-микролитровой пипетки, наполненной ультра-чистой водой, во влагалище.Аккуратно смойте четыре-пять раз, чтобы собрать образец, и депонировать окончательный флеш вагинальной жидкости на стеклянную горку. Затем наблюдайте неоближенный вагинальный флеш под световым микроскопом при увеличении 20X. Для воздействия озона и фильтрованного воздуха поместите максимум четырех мышей в один из двух отдельных 1,2-литровых стеклянных контейнеров с проволочными крышками сетки.Поместите один стеклянный контейнер в озоновую камеру и один в фильтрованную камеру воздействия воздуха. Затем отрегулируйте концентрацию озона до двух частей на миллион, удалив контейнер через три часа. Через четыре часа после воздействия, дезинфицировать открытые поверхности кожи первой экспериментальной мыши с 70% этанола и отрезать грудную клетку подвергать сердце и легкие.Используйте типсы, чтобы погрузить 1,5 миллилитр RNase свободной микро центрифуги трубки в жидком азоте, и оснастки заморозить собранных легких в жидком азоте. Затем используйте пульверизатор ткани из нержавеющей стали, чтобы масцератировать все легкое, и разделить распыленной ткани между двумя 1,5 миллилитров микроцентрифуг труб. После сбора урожая и распыления легких от всех животных таким же образом, добавить 500 микролитров гуанидиниума тиоцианата в каждый образец и последовательно гомогенизировать каждую ткань с 18, 21 и 23 иглы датчика.После последней гомогенизации добавьте 500 микролитров этанола в каждый образец перед вихрем в течение 15 секунд. Загрузите смеси в отдельные колонки спина в отдельных трубках сбора для центрифугации и отбросить потоковые ветви. Для лечения DNase 1 добавьте 400 микролитров буфера промывки РНК к каждому столбецу для другой центрифугации и смешайте пять микролитров DNase 1 и 75 микролитров буфера пищеварения ДНК на образец в трубках, свободных от RNase.Добавить смесь непосредственно в колонке матрицы для 15-минутной инкубации при комнатной температуре, а затем два 400 микролитер РНК предварительно промыть раствор моет центрифугации. Чтобы утоить РНК, добавьте 35 микролитров воды без DNase RNase непосредственно к каждой матрице столбца для окончательной центрифугации и измерьте общую концентрацию РНК и чистоту каждого образца на спектрофотометре. Затем храните РНК при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Для ретротранскриптирования малых RNase, добавить 200 нанограммов общей РНК в 10 микролитров предполетного раствора в одну трубку обратной транскрипции реакции смеси на образец. После смешивания, кратко центрифуга образцов и поместить их на лед до их инкубации. Затем инкубировать трубки в течение 60 минут при 37 градусах по Цельсию, а затем пятиминутную инкубацию при 95 градусах по Цельсию.В конце второй инкубации разбавляйте CDNA 200 микролитров воды без RNase на 20 микролитровую реакцию обратной транскрипции и добавляйте 10 микролитров каждого образца смеси реакции к каждому колодец предустановленной воспалительной реакции мыши и массива микроРНК autoimmunity. Стадию проэструса можно определить по наличию круглых и хорошо сформировавшейся нуклеиновых эпителиальных клеток. Когда мышь находится в стадии эструса, в мазке наблюдаются плотно упакованные скопления ануклеированных, оцинковых и плоскоклеточных эпителиальных клеток.Во время метеструса видны окаменелые эпителиальные клетки и полиморфонуклеарные лейкоциты. В diestrus, лейкоциты, как правило, более распространены. РНК, извлеченная из четырех легких мыши, как было продемонстрировано, показывает концентрации нуклеиновой кислоты в диапазоне от 1198 до 2178 нанограмм на микролитер и среднее соотношение A260 к A280 между 2,01 и 2,02, и среднее соотношение A260 к A230 между 2.139 и 2.223.В этой таблице показаны двукратные изменения в экспрессии микроРНК между озоном и фильтрованными воздушными мышами. После целевого фильтра микроРНК и анализа ядра для 14 микроРНК, чтобы получить значительное соотношение журналов экспрессий и значений P, эти данные могут быть отображены целевым фильтром микроРНК. Основной анализ также содержит информацию о канонических путях, болезнях и функциях, регуляторных службах и сетях.Кроме того, программное обеспечение для функционального анализа может быть использовано для получения сетевого анализа, который показывает связь между микроРНК, представляющими интерес, и другими молекулами. При попытке этой процедуры, важно, чтобы проверить цикл estrus ежедневно, по крайней мере три последовательных циклов до проведения эксперимента. После этой процедуры, другие методы могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о экспрессии генов легких воспалительных через цикл эструса.После его развития, этот метод проложил путь для других исследователей в области иммунитета легких, чтобы исследовать механизмы регулирования половых гормонов с использованием других моделей.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Индукция экспериментального аутоиммунного гипофизит в SJL Мыши

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Измерение бактериальной нагрузки и иммунного ответа в мышей, инфицированных Listeria моноцитогенес</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Правого желудочка систолическое давление измерений в сочетании с Harvest легких и иммунной образцы тканей у мышей

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Измерение Местные Анафилаксия у мышей

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

МикроРНК основе Регулирование пикорнавирусы тропизм

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Оценка цитотоксических и иммуномодулирующих эффектов веществ в легкое человека точности cut ломтики

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...