Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por subvenciones de NIH K01HL133520 (PS) y K12HD055882 (PS). Los autores agradecen a Dr. Joanna Floros para la ayuda con experimentos de exposición de ozono.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Penn State University.
1. evaluación de la fase del ciclo estral
<ol><li>Frenar correctamente una hembra de ratón C57BL/6 (8-9 semanas) utilizando la técnica de sujeción con una sola mano ratón descrita en Machholz et al10.</li>
	<li>Llenar la pipeta plástica estéril con 10 μL de agua ultra pura.</li>
	<li>Introduzca la punta de la pipeta de pl...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

Perfiles de microARN es una técnica ventajosa para investigación mecanicista y diagnosis de la enfermedad. En este manuscrito, se definió un protocolo para evaluar la expresión de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios en los pulmones de ratones femeninos expuestos a ozono en etapas del ciclo estral diferentes. Métodos para la determinación del ciclo estral, como el método de detección visual, han sido descrito16. Sin embargo, estos dependen de las mediciones de una sola v...

microRNAs (miRNAs) son cortos (19 a 25 nucleótidos), que ocurre naturalmente, no-codificación moléculas de ARN. Secuencias de miRNAs son evolutivas conservada entre especies, lo que sugiere la importancia de los miRNAs en la regulación de funciones fisiológicas1. perfiles de expresión de microRNA ha demostrado para ser útil para la identificación de miRNAs que son importantes en la regulación de una variedad de procesos, incluyendo la respuesta inmune, diferenciación celular, desarrollo y apoptosis2. Más recientemente, miRNAs han sido reconocidos por su uso potencial en el diagnóstico de la enfermedad y terapéutica. Para los investigadores estudiando mecanismos de regulación génica, medición de expresión de miRNA puede iluminar modelos de nivel de sistemas de procesos regulatorios, especialmente cuando miRNA información se combina con perfiles de mRNA y otros datos de genoma-escala3. Por otro lado, los miRNAs también han demostrado ser más estable que los mRNAs en una gama de tipos de muestra y también son mensurables con mayor sensibilidad a las proteínas4. Esto ha llevado a un interés considerable en el desarrollo de miRNAs como biomarcadores para diversas aplicaciones diagnóstico moleculares, incluyendo enfermedades pulmonares.
En el pulmón, los miRNAs desempeñan papeles importantes en procesos de desarrollo y el mantenimiento de la homeostasis. Por otra parte, su expresión anormal se ha asociado con el desarrollo y progresión de varias enfermedades pulmonares5. Neumopatía inflamatoria inducida por contaminación del aire ha demostrado mayor severidad y peor pronóstico en las mujeres, lo que indica que las hormonas y el ciclo estral pueden regular pulmón innata inmunidad y miRNA expresión en respuesta a retos ambientales 6. en el presente Protocolo, utilizamos la exposición al ozono, que es un componente importante de la contaminación atmosférica, para inducir una forma de inflamación del pulmón en ratones hembra que se produce en ausencia de inmunidad adaptativa. Mediante el uso de ozono, estamos induciendo el desarrollo de hipersensibilidad de las vías respiratorias que se asocia con daño a las células epiteliales de las vías respiratorias y un aumento de neutrófilos y mediadores inflamatorios en las vías respiratorias proximales7. Actualmente, no existen protocolos bien-descritos para caracterizar y analizar miRNAs en el ciclo estral en ratones expuestos al ozono.
A continuación, describimos un método simple para identificar las etapas del ciclo estral y la expresión de miRNA en el tejido de pulmón de ratones femeninos expuestos a ozono. También abordamos enfoques eficaces bioinformática a miRNA de descubrimiento y objetivo de identificación, con énfasis en biología computacional. Analizamos los datos de microarray utilizando limma, un software de R/Bioconductor que proporciona una solución integrada para el análisis de datos del gene expresión experimentos8. Análisis de datos de matriz PCR de limma tiene una ventaja en términos de poder sobre procedimientos de prueba t de base cuando se utiliza un número pequeño de muestras de matrices para comparar la expresión. Para comprender el contexto biológico de los resultados de expresión de miRNA, entonces utilizamos el software de análisis funcional. Para entender los mecanismos de regulación transcripcionales cambios y predecir resultados probables, el software combina conjuntos de datos de expresión de miRNA y el conocimiento de la literatura9. Esto es una ventaja en comparación con el software que sólo buscan enriquecimiento estadístico en superposición a conjuntos de miRNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

Perfiles de microARN (miARN) ha sido de interés para los investigadores que trabajan en diversas áreas de investigación de biología y medicina. Los estudios actuales muestran un promisorio futuro de miRNAs en el diagnóstico y cuidado de enfermedades pulmonares. Aquí, se define un protocolo para miRNA perfilado para medir la abundancia relativa de un grupo de miRNAs predicho para regular genes inflamatorios en el tejido pulmonar de un modelo de ratón de inflamación de las vías respiratorias inducida por ozono. Ya se ha demostrado que los niveles de hormonas sexuales circulantes pueden afectar la regulación de la inmunidad innata del pulmón en las mujeres, el propósito de este método es describir un inflamatorio miRNA perfiles de protocolo en los ratones hembra, teniendo en cuenta el ciclo estral etapa de cada animal en el momento de exposición al ozono. Nos dirigimos también a enfoques de la bioinformática aplicable a miRNA descubrimiento y objetivo de los métodos de identificación usando limma, un software de R/Bioconductor, y software de análisis funcional para comprender el contexto biológico y vías asociadas con expresión diferencial de miRNA.

Los diferentes tipos celulares observados en los frotis se utilizan para identificar la etapa del ciclo estral del ratón (figura 1). Estos están identificados por la morfología de la célula. Durante el proestro, las células son casi exclusivamente agrupaciones de células epiteliales nucleadas en forma de redondo, bien formadas (figura 1A). Cuando el ratón está en la etapa de estro, las células son células epiteliales sq...

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Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroARN pulmón perfilado a través de la el ciclo estral en ratones expuestos al ozono

Aquí se describe un método para evaluar la expresión pulmonar de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios utilizando ratones expuestos al ozono o aire filtrado en las diferentes etapas del ciclo estral.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad pulmonar sobre cómo evaluar la expresión de microRNAs que se predicen para regular los genes inflamatorios dentro del pulmón. Esta técnica ofrece la forma sencilla de identificar las contribuciones de las hormonas circulantes a la expresión del microARN pulmonar. Para evaluar la etapa del ciclo estroso, sujeta manualmente un ratón hembra de ocho a nueve semanas de edad e introduce la punta de una pipeta de plástico de 10 microlitrotro llena de agua ultra pura en la vagina.Enjuague suavemente de cuatro a cinco veces para recoger una muestra y deposite el rubor final del líquido vaginal en un portaobjetos de vidrio. A continuación, observe el color vaginal no manchado bajo un microscopio de luz con aumento de 20X. Para exposiciones de ozono y aire filtrado, coloque un máximo de cuatro ratones en uno de los dos recipientes individuales de vidrio de 1,2 litros con tapas de malla de alambre.Coloque un recipiente de vidrio en una cámara de ozono y otro en una cámara de exposición de aire filtrada. A continuación, ajuste la concentración de ozono a dos partes por millón, retirando el recipiente después de tres horas. Cuatro horas después de la exposición, desinfectar la superficie de la piel expuesta del primer ratón experimental con 70%etanol y cortar la caja torácica para exponer el corazón y los pulmones.Utilice fórceps para sumergir un tubo de micro centrífuga libre de RNase de 1,5 mililitros en el nitrógeno líquido, y congele el pulmón cosechado en el nitrógeno líquido. Luego usa un pulverizador de tejido de acero inoxidable para enmascarar todo el pulmón, y divide el tejido pulverizado entre dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Después de cosechar y pulverizar los pulmones de todos los animales de esta misma manera, agregue 500 microlitros de tiocianato de guanidinio a cada muestra y homogeneice secuencialmente cada tejido con agujas de calibre 18, 21 y 23.Después de la última homogeneización, añadir 500 microlitros de etanol a cada muestra antes de vórtice durante 15 segundos. Cargue las mezclas en columnas de espín individuales en tubos de recogida individuales para la centrifugación y deseche los flujos a través. Para el tratamiento con DNase 1, añada 400 microlitros de tampón de lavado de ARN a cada columna para otra centrifugación y mezcle cinco microlitros de DNase 1 y 75 microlitros de tampón de digestión de ADN por muestra en tubos libres de RNase.Agregue la mezcla directamente a las matrices de columna para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, seguida de dos lavados de solución de prelavado de ARN de 400 microlitros por centrifugación. Para eluir el ARN, agregue 35 microlitros de agua libre de DNase RNase directamente a cada matriz de columna para una centrifugación final, y mida la concentración total de ARN y pureza de cada muestra en un espectrofotómetro. A continuación, almacene el ARN a menos 80 grados centígrados.Para la retrocripción de RNase pequeña, agregue 200 nanogramos de ARN total en 10 microlitros de solución de prelavado a un tubo de mezcla de reacción de transcripción inversa por muestra. Después de mezclar, centrifuga brevemente las muestras y colóquelas sobre hielo hasta su incubación. A continuación, incubar los tubos durante 60 minutos a 37 grados centígrados, seguido de una incubación de cinco minutos a 95 grados centígrados.Al final de la segunda incubación, diluir el CDNA con 200 microlitros de agua libre de RNase por reacción de transcripción inversa de 20 microlitros, y añadir 10 microlitros de cada muestra de mezcla de reacción a cada pozo de una respuesta inflamatoria de ratón precargada y una matriz de microRNA PCR autoinmunitaria. La etapa proestrus se puede identificar por la presencia de células epiteliales nucleadas de forma redonda y bien formadas. Cuando el ratón está en la etapa estrus, se observan racimos densamente llenos de células epiteliales anucleadas, cornificadas y escamosas en el frotis.Durante los metestrus, se observan células epiteliales cornificadas y leucocitos polimorfonucleares. En los diestrus, los leucocitos son generalmente más frecuentes. Arn extraído de cuatro pulmones de ratón, como se ha demostrado, exhiben concentraciones de ácido nucleico que oscilan entre 1198 y 2178 nanogramos por microlitro y una relación media de A260 a A280 entre 2,01 y 2,02, y una relación media de A260 a A230 entre 2,139 y 2,233.En esta tabla, se muestran cambios dobles en la expresión de microRNA entre el ozono y los ratones expuestos al aire filtrado. Después del filtro de destino de microRNA y el análisis del núcleo para 14 microRNAs, para obtener la relación de registro de expresiones significativa y los valores P, estos datos pueden ser mapeados por el filtro de destino de microRNA. El análisis básico también proporciona información sobre las vías canónicas, las enfermedades y la función, los reguladores y las redes.Además, el software de análisis funcional se puede utilizar para producir un análisis de red que muestre la relación entre los microARN de interés y otras moléculas. Al intentar este procedimiento, es importante comprobar el ciclo de estrus diariamente durante al menos tres ciclos consecutivos antes de realizar un experimento. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para responder preguntas adicionales sobre la expresión génica inflamatoria pulmonar a través del ciclo de estrus.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para otros investigadores en el campo de la inmunidad pulmonar para explorar mecanismos de regulación de la hormona sexual utilizando otros modelos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Ventricular derecha sistólica mediciones de presión en combinación con la cosecha de pulmón y muestras de tejido inmune en ratones

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Medición anafilaxia local en ratones

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Reglamento basadas en microARN de picornavirus tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Evaluación de la citotóxica y efectos inmunomoduladores de sustancias en lonchas de pulmón humano de precisión de corte

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...