Name: lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Denna forskning stöds av bidrag från NIH K01HL133520 (PS) och K12HD055882 (PS). Författarna vill tacka Dr Joanna Floros för hjälpen med ozon exponering experiment.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Penn State University.
1. bedömning av östruscykel scenen
<ol><li>Korrekt hindra en kvinna C57BL/6 mus (8 – 9 veckor gamla) använder en hand mus återhållsamhet tekniken som beskrivs i Machholz et al.10.</li>
	<li>Fyll sterila plast pipetten med 10 μL av ultrarent vatten.</li>
	<li>Införa spetsen av plast pipett i slidan.</li>
	<li>Försiktigt...

<ol>
	<li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation.">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li><li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+microRNAs+regulate+gene+expression?.">How do microRNAs regulate gene expression?.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases.">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li><li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases.">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li><li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation.">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).</li><li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy.">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).</li><li>Kr&#228;mer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis.">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone.">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression.">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li><li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Models+for+Microarray+and+RNA-Seq+Data+User's+Guide.">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology.">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity.">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+purification-+precipitation+methods.">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limma:+linear+models+for+microarray+data.">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+the+microRNA+sequence+database.">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li><li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TarBase:+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets.">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005 (2015).</li><li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRecords:+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions.">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li><li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression.">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li></ol>

MikroRNA profilering är en fördelaktig teknik för både sjukdomsdiagnos och mekanistiska forskning. I detta manuskript definierat vi ett protokoll för att utvärdera uttrycket av MicroRNA som förutspås reglerar inflammatoriska gener i lungorna av kvinnliga möss som utsätts för ozon i olika östruscykel stadier. Metoder för bestämning av östruscykel, såsom visuell identifieringsmetoden, har varit beskrivs16. Dock dessa förlitar sig på enstaka mätningar och därför är opålitliga. ...

mikroRNA (Mirna) är kort (19 till 25 nukleotider), naturligt förekommande, icke-kodande RNA-molekyler. Sekvenser av MicroRNA är evolutionärt bevarade mellan arter, tyder på vikten av MicroRNA reglera fysiologiska funktioner1. mikroRNA uttryck profilering har visat sig vara till hjälp för att identifiera MicroRNA som är viktiga i regleringen av olika processer, inklusive immunförsvaret, celldifferentiering, utvecklingsprocesser och apoptos2. Mer nyligen, MicroRNA erkänts för deras potentiella användning i sjukdom diagnostik och therapeutics. För forskare som studerar mekanismer för genreglering, kan mäta miRNA uttryck upplysa system-nivå modeller av tillsynsprocesser, särskilt när miRNA information kopplas till mRNA profilering och andra genomet-skala data3. Däremot, MicroRNA har också visat sig vara stabilare än mRNA i en rad olika provtyper och är också mätbara med större känslighet än proteiner4. Detta har lett till betydande intresse i utvecklingen av MicroRNA som biomarkörer för olika molekylär diagnostik program, inklusive lungsjukdomar.
I lungan spelar MicroRNA viktiga roller i utvecklingsprocesser och underhåll av homeostas. Dessutom har deras avvikande uttryck associerats med utveckling och progression av olika lungsjukdomar5. Inflammatorisk lungsjukdom som orsakas av luftföroreningar har visat större stränghet och sämre prognos hos kvinnor, vilket indikerar att hormoner och östruscykel kan reglera lung medfödd immunitet och miRNA uttryck i reaktioner på olika miljöutmaningar 6. i detta protokoll, vi använder ozonexponering, som är en viktig del av luftföroreningar, för att framkalla en form av lunginflammation hos honmöss som uppstår i avsaknad av adaptiv immunitet. Med hjälp av ozon, vi förmå utvecklingen av hyperreaktivitet i luftvägarna som är associerad med luftvägarna epitelial cellskador och en ökning av neutrofiler och inflammatoriska mediatorer i proximala airways7. För närvarande finns det inte väl beskrivna protokoll att karakterisera och analysera MicroRNA över östruscykel i ozon-exponerade möss.
Nedan beskriver vi en enkel metod för att identifiera östruscykel stadier och miRNA uttryck i lungvävnad av kvinnliga möss som utsätts för ozon. Vi också ta effektiv bioinformatik metoder miRNA upptäckten och target identifiering, med betoning på beräkningsbiologi. Vi analyserar microarray data med hjälp av limma, en R/Bioconductor-programvara som erbjuder en integrerad lösning för att analysera data från gen uttryck experiment8. Analys av PCR-array data från limma har en fördel när det gäller makt över t-test baserat tillvägagångssätt när du använder litet antal matriser/prover för att jämföra uttryck. För att förstå biologiska samband med miRNA uttryck resultat, använde vi sedan programvaran funktionell analys. För att förstå de mekanismer som reglerar transkriptionell förändringar och att förutsäga sannolika utfall, kombinerar programvaran miRNA-uttryck datamängder och kunskap från litteraturen9. Detta är en fördel jämfört med programvara som titta bara för statistiska berikning i överlappande uppsättningar av microRNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10813012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-25</td>
			<td>Capacity: 1.7mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2951TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>MW3-H5</td>
			<td>10X and 20X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>55853</td>
			<td>90 mg/kg. Controlled drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Sterile Solution</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>139-236</td>
			<td>10mg/kg. Controlled Drug.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dilute to 70% ethanol with water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329654</td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501221, 504613</td>
			<td>14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#730;C freezer</td>
			<td>Forma</td>
			<td>7240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum&#160;Bessman Tissue Pulverizers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-418-1</td>
			<td>Capacity: 10 to 50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Inflammatory Response &#38; Autoimmunity miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MIMM-105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12225</td>
			<td>for 20 &#956;l reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>https://office.microsoft.com/excel/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Software</td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler or chilling/heating block</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR cycler</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettor</td>
			<td>General Lab Supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1003-3-48</td>
			<td>48 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010-1-4</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA pre-wash buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1020-2-25</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet ozone analyzer</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>Model T400</td>
			<td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>Sierra Instruments Inc</td>
			<td>Flobox 951/954</td>
			<td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung microrna profiling across the estrous cycle in ozone-exposed mice

MikroRNA (miRNA) profilering har blivit intressant för forskare som arbetar inom olika forskningsområden av biologi och medicin. Aktuella studier visar en lovande framtid använda MicroRNA för diagnos och vård av lungsjukdomar. Här definierar vi ett protokoll för miRNA profilering för att mäta det relativa överflödet av en grupp av MicroRNA förutspådde för att reglera inflammatoriska gener i lungvävnad från av en ozon-inducerad luftvägarna inflammation musmodell. Eftersom det har visats att cirkulerande könshormon nivåer kan påverka regleringen av lung medfödd immunitet hos honor, är syftet med denna metod att beskriva en inflammatorisk miRNA profilering protokollet hos honmöss, med hänsyn till östruscykel skede av varje djur vid tidpunkten för ozonexponering. Vi också ta tillämplig bioinformatik förhållningssätt till miRNA upptäckten och målet identifieringsmetoder använder limma, en R/Bioconductor programvara, och funktionell analysprogramvara att förstå biologiska sammanhang och vägar i samband med differentiell miRNA uttryck.

De olika celltyper som observerats i utstryk används för att identifiera musen östruscykel scenen (figur 1). Dessa identifieras av cellmorfologi. Under Proöstrus är cellerna nästan uteslutande kluster av runda, välformade kärnförsedda epitelceller (figur 1A). När musen är i brunst scenen, är cellerna cornified skivepitelcancer epitelceller, närvarande i tätt packade kluster (figur 1B). ...

Watch this Scientific Journal Video about Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice at JoVE.com

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Lungan mikroRNA profilering över the östruscykel i ozon-exponerade möss

Här beskriver vi en metod för att bedöma lung uttryck av MicroRNA som förutspås för att reglera inflammatoriska gener med möss utsätts för ozon eller filtrerad luft i olika skeden av östruscykel.

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i lung-immunitet området om hur man bedömer uttrycket av microRNAs som förutspås reglera inflammatoriska gener i lungan. Denna teknik erbjuder det enkla sättet att identifiera bidragen från cirkulerande hormoner till lungmikroNA-uttryck. För att bedöma estrous cykelstadiet, manuellt begränsa en åtta till nio veckor gammal kvinnlig mus och införa spetsen på en plast 10-microliter pipett fylld med ultra rent vatten i slidan.Spola försiktigt fyra till fem gånger för att samla in ett prov, och deponera den slutliga spolningen av vaginal vätska på en glasrutschkana. Observera sedan den obefläckade vaginal flush under ett ljus mikroskop vid 20X förstoring. För ozon- och filtrerad luftexponering, placera högst fyra möss i en av två enskilda 1,2 liters glasbehållare med trådnätlock.Sätt en glasbehållare i en ozonkammare och en i en filtrerad luftexponeringskammare. Justera sedan ozonkoncentrationen till två delar per miljon, ta bort behållaren efter tre timmar. Fyra timmar efter exponering, desinficera den exponerade hudytan av den första experimentella musen med 70%etanol och skär bort bröstkorgen för att exponera hjärta och lungor.Använd tång för att dränka ett 1,5 milliliter RNase-fritt mikrocentrifugrör i det flytande kvävet och snäpp frysa den skördade lungan i det flytande kvävet. Använd sedan en rostfri vävnad pulverizer att mascerate hela lungan, och dela den pulveriserade vävnaden mellan två 1,5 milliliter microcentrifug rör. Efter skörd och pulverisering av lungorna från alla djur på samma sätt, tillsätt 500 mikroliter av guanidiniumtiocyanat till varje prov och sekventiellt homogenisera varje vävnad med 18, 21 och 23 mätare nålar.Efter den sista homogeniseringen, tillsätt 500 mikroliter av etanol till varje prov innan virvelning i 15 sekunder. Ladda blandningarna i enskilda spinnkolonner i enskilda uppsamlingsrör för centrifugering och kasta genomströmningsgenomströmningen. För DNase 1-behandling, tillsätt 400 mikroliter av RNA-tvättbuffert till varje kolumn för en annan centrifugering och blanda fem mikroliter av DNase 1 och 75 mikroliter av DNA-rötningsbuffert per prov i RNase-fria rör.Tillsätt blandningen direkt i kolonnmatriserna för en 15-minuters inkubation vid rumstemperatur, följt av två 400 mikroliter RNA-förtvättslösningtvättar genom centrifugering. För att elera RNA: ERNA, tillsätt 35 mikroliter DNase RNase-fritt vatten direkt till varje kolonnmatris för en slutlig centrifugering, och mät den totala RNA-koncentrationen och renheten hos varje prov på en spektrofotometer. Förvara sedan RNA vid minus 80 grader Celsius.För retrotranscription av små RNase, tillsätt 200 nanogram av totalt RNA i 10 mikroliter av prewash lösning till ett rör av omvänd transkription reaktion mix per prov. Efter blandning, kort centrifug proverna och placera dem på is tills deras inkubation. Därefter inkubera rören i 60 minuter vid 37 grader Celsius, följt av en fem minuters inkubation vid 95 grader Celsius.I slutet av den andra inkubationen späd cdna med 200 mikroliter av RNase-fritt vatten per 20 microliter omvänd transkription reaktion, och lägga till 10 mikroliter av varje reaktion mix prov till varje brunn av en förinläst mus inflammatoriska svar och autoimmunitet microRNA PCR array. Proestrus-stadiet kan identifieras genom närvaron av rundaformade och välformade kärnoriska epitelceller. När musen är i estrusstadiet observeras tätt packade kluster av anucleerade, cornified och squamous epitelceller i utstryket.Under metestrus ses cornified epitelial celler och polymorphonuclear leukocytes. I diestrus, leukocyter är i allmänhet vanligare. RNA utvinns ur fyra mus lungor, som visat, uppvisar nukleinsyra koncentrationer mellan 1198 och 2178 nanogram per mikroliter och genomsnittliga A260 till A280 förhållandet mellan 2,01 och 2,02, och en genomsnittlig A260 till A230 förhållandet mellan 2,139 och 2,223.I denna tabell visas logg tvåfaldiga förändringar i mikroRNA-uttryck mellan ozon och filtrerade luftexponerade möss. Efter microRNA målfilter och kärnanalys för 14 microRNAs, för att erhålla det signifikanta uttrycksloggförhållandet och P-värden, kan dessa data mappas av mikroRNA-målfiltret. Kärnanalysen ger också information om kanoniska vägar, sjukdomar och funktion, regulatorer och nätverk.Vidare kan den funktionella analysprogramvaran användas för att ta fram en nätverksanalys som visar förhållandet mellan de mikroRNA av intresse och andra molekyler. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att kontrollera estrus cykeln dagligen för minst tre på varandra följande cykler innan de genomför ett experiment. Efter denna procedur, andra metoder kan utföras för att svara på ytterligare frågor om lunginflammatoriska genuttryck över estrus cykeln.Efter det utveckling, denna teknik banade väg för andra forskare inom området lungimmunitet att utforska mekanismer för könshormon reglering med hjälp av andra modeller.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Induktion av Experimentell Autoimmun Hypophysitis i SJL Möss

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Att mäta bakteriehalten och immunsvar hos möss som blivit infekterade med Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Höger systolisk tryckmätningar i kombination med Skörd av lung-och Immune vävnadsprover i möss

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Mätning Lokala Anafylaxi i möss

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

MicroRNA baserad reglering av Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila yttre membranvesiklar: Isolering och analys av deras pro-inflammatoriska Potential på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Bedömning av den cytotoxiska och immunmodulerande effekter av ämnen i Human Precision-cut Lung skivor

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...